Бассейн бакулева: Бассейн Юность | Бассейны Москвы

АПФ в сыворотке / плазме крови, семенной жидкости или гомогенатах органов человека измеряли с помощью флуориметрического анализа с двумя субстратами АПФ, 2 мМ Z-Phe-His-Leu (ZPHL) и 5 ​​мМ Hip-His-Leu (HHL). , при pH 8.3 [15]. Вкратце, аликвоты 20-40 мкл образцов, разведенных в PBS-BSA (0,1 мг / мл), добавляли к 200 мкл субстрата АПФ и инкубировали в течение подходящего времени при 37 ° C. Продукт His-Leu определяли количественно флуориметрически путем образования комплекса с или -фтальдиальдегид.

Иммунологическая характеристика АПФ (анализ иммунопреципитации на планшете)

Девяносто шестилуночных планшетов (высокое связывание, Corning Inc., Корнинг, Нью-Йорк, США) покрывали mAb против АПФ через козий антимышиный IgG (Пирс, Рокфорд, Иллинойс, США или IMTEK, Москва, Россия) мостиком [ 16] и инкубировали с различными источниками ACE, которые были уравновешены по активности ACE с ZPHL в качестве субстрата.После отмывания несвязавшегося АПФ активность связанного с планшетом АПФ измеряли путем добавления субстрата для АПФ (ZPHL) непосредственно в лунки [16]. Шестнадцать мАт к человеческому АПФ были получены в нашей лаборатории [5], в то время как мАт BB9 [17] к N-домену АПФ были любезно предоставлены Полом Дж. Симмонсом (в то время Фонд молекулярной медицины Брауна, Научный центр здравоохранения Техасского университета, Хьюстон, США). Техас, США). Дополнительные mAb к ACE (клон 2h5 к N-домену ACE) были созданы в сотрудничестве с Ильей Н. Трахтом и Гаврилом Ф.Калантаров (Колумбийский университет, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США) (не опубликовано). Для большинства экспериментов мы использовали панель из 16 мАт, которые были созданы в нашей лаборатории, в то время как в некоторых мы тестировали также два новых мАт.

Секвенирование и генотипирование

Геномная ДНК была получена из сердечной ткани пациентов № 11 и № 27 с помощью QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Германия) и 9 экзонов гена ACE (14–20 ^-й , 23 ^-й и 25 ^-й). ) были секвенированы с использованием праймеров, разработанных Dufour et al.[18], а также из других источников (перечисленных в таблице 1). Вкратце, ПЦР проводили при следующих условиях: 95 ° C в течение 5 мин, а затем 40 циклов, включая плавление при 95 ° C в течение 10 с, отжиг при Т _{, отжиг} (перечислено в таблице 1) в течение 10 с и удлинение при 72 °. C в течение 20 с. Продукты ПЦР разделяли в 1% агарозном геле), выделяли с помощью набора для экстракции геля QIAquick (Qiagen) и секвенировали с использованием тех же праймеров, набора для циклического секвенирования BigDye Terminator v3.1 (Thermo Fischer Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) и анализатора ДНК 3730xl. (Applied Biosystems, Уолтем, Массачусетс, США).

Статистический анализ

Все данные являются средними значениями ± SEM. Значимость анализировали с использованием теста Манна-Уитни с помощью STATISTICA 6 (StatSoft, Inc., OK).

Результаты и обсуждение

Ферментный анализ иммунного захвата (ACE)

Для того, чтобы количественно определить количество иммунореактивного белка АПФ и проанализировать изменения в локальной поверхностной конформации АПФ, мы использовали ферментный (АПФ) иммунозахватный анализ с панелью моноклональных антител к различным эпитопам на поверхности N- и С-доменов АПФ. [16, 19].Схема, иллюстрирующая метод, представлена ​​на рис. 1А. 96-луночный планшет с высоким связыванием покрывали различными mAb к ACE через мостик козьего антимышиного IgG (10 мкг / мл, 50 мкл в каждой лунке) в PBS. После отмывки несвязанных мАт добавляли источник АПФ (обычно 2-20 мЕ / мл), а затем, после инкубации в течение ночи и отмывки несвязанного АПФ, субстрат для АПФ (обычно 1 мМ ZPHL в 100 мМ фосфатном буфере, pH 8,3, содержащий Добавляли 300 мМ NaCl и оценивали активность осажденного АПФ непосредственно в лунках [16].Как правило, линейная зависимость добавленной активности АПФ и осажденной активности АПФ в лунках (более нагруженная активность АПФ — более осажденная активность АПФ) наблюдалась с не более чем 20 мЕд / мл загруженной активности АПФ, особенно когда mAb с высоким связыванием, например, Использовали mAb 9B9 (рис. 1B – 1D). Чтобы сохранить ценные mAb, мы использовали не более 3 мкг / мл чистых mAb (или 1/20 разведения среды для культивирования гибридомных клеток), которых было достаточно для покрытия (рис. 1C и 1D). Обычно количество иммунореактивного белка АПФ оценивали с использованием самого сильного mAb к ACE, клона 9B9 [16, 20], в то время как образец осаждения активности ACE с помощью панели mAb к различным эпитопам на ACE — конформационный отпечаток ACE — использовали для оценка локальных конформационных различий в топографии поверхности ACE из-за болезни [5, 7, 21] или из-за тканевого происхождения ACE [5, 9, 10].

Рис. 1. Ферментный (АПФ) иммунозахват.

А . Схема метода. Козьи антимышиные IgG загружают в 96-луночный планшет, чтобы минимизировать неспецифическую адсорбцию как mAb, так и ACE, а также предотвратить предполагаемую денатурацию некоторых mAb в результате контакта с пластиком. После отмывки несвязанного антимышиного IgG на планшет наносят mAb к АПФ и после еще одной промывки добавляют проанализированный источник АПФ. Количество АПФ в комплексе с любым mAb оценивается путем измерения активности осажденного АПФ по отношению к конкретному субстрату, обычно ZPHL, добавляемому непосредственно в лунки. Б . Зависимость флуоресценции (отражающей относительную активность АПФ в лунках) от активности загруженного АПФ в лунках, покрытых сильным mAb 9B9 (10 мкг / мл) и слабым mAb 1E10 (10 мкг / мл). С . Зависимость сигнала флуоресценции от активности загруженного АПФ при различных концентрациях загруженного сильного mAb 9B9. Д . Зависимость сигнала флуоресценции от активности загруженного АПФ при различных концентрациях загруженного слабого mAb 1E10.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0209861.g001

Большим преимуществом этого подхода является возможность измерения активности АПФ в плазме, взятой с ЭДТА, или в плазме, содержащей ингибиторы АПФ, поскольку ингибиторы ЭДТА или АПФ вымываются на этапе промывки с помощью дистиллированная вода с Твин-20, в то время как АПФ все еще связан с mAb. Мы определили количество промывок, необходимых для удаления сильного специфического ингибитора АПФ, эналаприлата, из комплекса с АПФ. Стоит отметить, что, хотя соединение может быть сильным ингибитором АПФ в физиологических условиях, его константа связывания с АПФ значительно снижается в отсутствие хлорида [22], в данном случае в дистиллированной воде.Мы измерили активность АПФ, осажденного 4 различными мАт с использованием двух субстратов (ZPHL и HHL), и использовали соотношение их скоростей гидролиза, соотношение ZPHL / HHL, как чувствительное считывание присутствия ингибитора в комплексе с АПФ [15 , 23] –Рис. 2. Мы обнаружили, что остаточные уровни ингибитора АПФ в АПФ, осажденном разными mAb, различаются, что отражается в различных соотношениях ZPHL / HHL при 1–3 промываниях, но пяти промывок было достаточно для полной диссоциации эналаприлат из комплекса с АПФ, осажденный любым mAb (рис. 2).

Рис. 2. Влияние промывки планшетов на диссоциацию ингибитора АПФ от АПФ.

Остаточная активность АПФ по отношению к субстратам, HHL и ZPHL, а также соотношение скоростей гидролиза этих субстратов, соотношение ZPHL / HHL, определяли в лунках, покрытых козьим антимышиным IgG, четырьмя mAb к ACE ( сильная и слабая), а затем смесь очищенного АПФ семенной жидкости с ингибитором эналаприлат (100 нМ) после разного количества промываний водой с 0,05% (об. / об.) Твин 20.Отношение ZPHL / HHL для АПФ в растворе в присутствии ингибитора (красная полоса в правом столбце) показано для сравнения. Данные выражены в% от контроля (т. Е. АПФ без ингибитора) и представлены как среднее значение не менее 3 независимых экспериментов. Раскраска здесь и на других рисунках следующая: значения, увеличенные более чем на 20%, выделены оранжевым цветом, более 50% выделены темно-оранжевым, более чем 100% выделены красным. Значения, уменьшенные более чем на 20%, выделены желтым цветом.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0209861.g002

Ранее мы обнаружили, что характер преципитации активности АПФ набором mAb — конформационный отпечаток АПФ — может быть чувствительным к присутствию детергентов [5 ]. Поскольку мы активно использовали этот подход для изучения тонкой конформации АПФ из различных тканей человека — тканевой специфичности АПФ [9–10, 21], мы изучили влияние Тритона Х-100, используемого для солюбилизации АПФ, на конформационные отпечатки АПФ. .Фиг.3 демонстрирует влияние различных концентраций Тритона Х-100 на АПФ, очищенный из гомогената легких человека. Оказалось, что связывание 4 мАт с очищенным АПФ было чувствительным к присутствию детергента — двух мАт, i1A8 и 5F1, к различным эпитопам в N-домене и двух мАт, 1B8 и 3F11, к эпитопам в C-домене ( Рис 3). Интуитивно понятно, что влияние детергента на связывание mAb с АПФ должно быть больше с мембранной формой АПФ, то есть с ферментом, содержащим трансмембранный якорь, чем с растворимым АПФ.Ранее мы показали [24], что даже очищенная мембранная форма АПФ из легких крупного рогатого скота несла значительное количество Тритона Х-100. Итак, мы протестировали влияние тритона на связывание mAb с различными АПФ и обнаружили, что действительно, хотя эффект тритона был четко виден с легочным АПФ, в неочищенном гомогенате или очищенном ферменте (рис. 4A и 4B), присутствие тритона действительно не влияет на связывание mAb с растворимыми АПФ, рекомбинантным АПФ (фиг. 4C) или ACE из семенной жидкости (фиг. 4D).

Рис. 3. Влияние TritonX-100 на связывание mAb с очищенным АПФ легких.А-С.

Влияние различных концентраций детергента Triton X-100 на преципитацию активности ACE из ACE, очищенного из гомогената легких человека. Данные выражены в процентах от контроля (т.е. без Triton X-100) и представлены как среднее значение по меньшей мере 3 независимых экспериментов. Н / Т — не проверенные моноклональные антитела. Раскраска такая же, как в легенде к рис. 2, и, кроме того, значения, уменьшенные более чем на 50%, выделяются темно-синим цветом.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0209861.g003

Рис. 4. Влияние 0,25% Triton X-100 на связывание mAb с различными ACE.

Данные выражены в% от контроля (т.е. источник ACE без Triton X-100) и представлены как среднее значение по крайней мере 3 независимых экспериментов. Н / Т — не проверенные моноклональные антитела. Раскраска такая же, как в легенде к рис. 3.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0209861.g004

Хранение гомогенатов тканей человека также может изменить свойства АПФ. Мы обнаружили, что хотя активность АПФ (с ZPHL в качестве субстрата) в гомогенате легких человека была достаточно стабильной в течение 4 недель хранения в холодильнике, хранение в морозильной камере при -20 ° C в течение более одного месяца приводило к полной потере Активность АПФ в гомогенатах тканей человека или лизатах клеток, экспрессирующих АПФ (не показано).Однако связывание некоторых mAb с ACE в гомогенате легких человека заметно изменилось уже после одной недели хранения в холодильнике, а также изменилось даже после короткого замораживания (фиг. 5). Эти данные указывают на изменение топографии поверхности глобулы белка АПФ при хранении, в то время как активные центры, расположенные глубоко внутри глобулы белка [25], сохраняют свои ферментативные функции. Это наблюдение согласуется с нашим предыдущим открытием [26] по вторым производным УФ-спектров растворов АПФ о том, что γ-облучение приводит к разложению остатков тирозина и триптофана на поверхности бычьего АПФ, происходящему даже при низких дозах, в то время как фермент сохранял свои свойства. полная ферментативная активность.

Рис. 5. Влияние хранения гомогената легких на распознавание АПФ с помощью mAb.

Готовили свежеприготовленный гомогенат легких человека и затем аликвотировали на отдельные объемы для хранения. Осаждение активности АПФ сравнивали для свежеприготовленного гомогената и того же гомогената, но хранились в течение разного времени и при разных температурах. А-С. Хранение гомогената при 4 ° C в течение разных периодов времени. Д . Кратковременное замораживание при -20 ° C. Данные выражены в процентах от контроля (т.е.е. начальное осаждение АПФ из свежеприготовленного гомогената легких) и представлено как среднее значение по меньшей мере 3 независимых экспериментов. Н / Т — не проверенные моноклональные антитела. Раскраска такая же, как в легенде к рис. 3.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0209861.g005

Таким образом, данные, представленные на рис. 3–5, демонстрируют, что мелкие изменения топографии поверхности ACE из разных источников должны измеряться одинаковыми (или аналогичными) ) условия с учетом присутствия мембранного якоря в некоторых молекулах АПФ, а также условия солюбилизации и хранения АПФ.

Обнаружение ингибиторов АПФ в крови пациента

Ранее мы продемонстрировали возможность обнаружения коммерческих ингибиторов АПФ в крови пациента с использованием двух разных подходов — расчета отношения скоростей гидролиза двух субстратов, отношения ZPHL / HHL [15] и расчета отношения связывание двух mAb, 1G12 (или 6A12) и 9B9, с АПФ [6], причем оба отношения увеличиваются в присутствии ингибиторов АПФ. Обнаружение и количественное определение ингибиторов АПФ в крови пациента (т.е. соблюдение антигипертензивной терапии) определенно имеет клиническое значение, поскольку пациенты с эффективным подавлением АПФ лучше контролируют артериальное давление, чем пациенты со слабым ответом на ингибиторы [27]. Помня об этом, мы точно сравнили чувствительность обоих методов (рис. 6) и продемонстрировали, что один из распространенных ингибиторов АПФ, эналаприлат, может быть обнаружен в крови пациента при концентрации 1 нМ с использованием соотношения ZPHL / HHL (рис. 6B и 6D) и даже при менее чем 0,1 нМ (фиг. 6C и 6D) с использованием подхода на основе mAb.Для справки: сообщалось, что концентрация эналаприлата в крови на пике (через 4 часа после перорального приема 10 мг эналаприла) составляет около 50 нМ [28]. Таким образом, даже «ограниченный» конформационный фингерпринт АПФ всего с двумя mAb позволяет получить ценную информацию.

Рис. 6. Обнаружение ингибиторов АПФ в плазме больных.

Два различных подхода к обнаружению ингибиторов АПФ в плазме пациентов сравнивались с использованием объединенной цитратной плазмы от 80 пациентов, не принимавших ингибиторы АПФ.В образцы плазмы добавляли различные концентрации эналаприлата. А-Б . Ферментативный подход. А . Активность АПФ определяли по скорости гидролиза двух субстратов, HHL и ZPHL, при различных концентрациях ингибитора АПФ эналаприлата,% от начальной активности АПФ. Б . Соотношение скоростей гидролиза субстратов HHL и ZPHL, соотношение ZPHL / HHL, определенное в присутствии различных концентраций эналаприлата,% от значения соотношения в отсутствие ингибитора. С . Анализ на основе антител: эффективность связывания mAb с АПФ при различных концентрациях эналаприлата,% от связывания в отсутствие ингибитора. Д . Сравнение ферментативных методов и методов на основе моноклональных антител. Влияние различных концентраций эналаприлата на два параметра: соотношение связывания mAb 1G12 и 9B9 с ACE, 1G12 / 9B9 и соотношение ZPHL / HHL. Данные выражены в% от контроля (т.е. без ингибитора АПФ эналаприлата) и представлены как среднее значение по меньшей мере 3 независимых экспериментов ± стандартное отклонение.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0209861.g006

Конформационный отпечаток АПФ крови от разных доноров

Мы количественно оценили преципитацию активности АПФ в образцах плазмы от разных доноров, используя лунки, покрытые (через козий-антимышиный мостик) 17 различными мышиными mAb против АПФ (фиг. 7). Относительное осаждение АПФ сильными mAb (9B9, 2B11, 3A5, 2H9) резко отличалось по сравнению с осаждением слабыми mAb (i1A8, 3G8, 1E10 и 3F11), вероятно, отражая разницу в их сродстве к ACE (фиг. 7A).Следует отметить, что некоторые моноклональные антитела продемонстрировали антикаталитический эффект на АПФ в растворе при концентрациях мкг / мл [6, 15], тогда как в анализе иммуноферментного захвата (при более низких концентрациях антикаталитический эффект не превышал 20% (S1 Рис. В [7]) по сравнению с 10-кратными различиями в сигналах флуоресценции, продемонстрированными АПФ, осажденным разными mAb, слабым и сильным (Рис. 7A). Таким образом, мы можем рассматривать антикаталитический эффект некоторых mAb в этом формате как незначительный.

Рис 7.Сравнительное связывание mAb с АПФ от разных доноров.

Конформационный фингерпринт ACE в плазме от доноров с набором mAb к ACE. А . Соотношение mAb / 9B9 для одного из доноров, 5 ^донор . Б . Отношение связывания mAb с АПФ в плазме донора 5 ^th к среднему значению для четырех доноров. С . Отношение преципитированной активности АПФ в плазме 5 ^-го донора к таковой 14 ^-го донора представлено для того, чтобы подчеркнуть различия в паттерне иммунопреципитации («конформационный отпечаток пальца») между АПФ из крови разных доноров. D, E . Отношение связывания mAb с АПФ в образцах сыворотки от двух разных доноров к среднему значению для трех доноров. Ф . Отношение связывания mAb с АПФ в объединенных образцах сыворотки от трех доноров к таковому для АПФ, объединенному из 80 образцов нормальной плазмы. Данные по связыванию mAb с ACE от всех доноров были предварительно нормализованы до связывания наиболее сильного mAb 9B9 с ACE от того же донора (как в A). Полученные значения использовали для расчета соотношений между различными донорами, выражали в% (B-F) и представляли как среднее значение по меньшей мере 3 независимых экспериментов.Н / Т — не проверенные моноклональные антитела. Раскраска такая же, как в легенде к рис. 3.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0209861.g007

Мы провели такой иммуно-захватный анализ с 8 случайно выбранными образцами плазмы от здоровых доноров в двух отдельных экспериментах с 5 и 3 донорами. Чтобы увидеть предполагаемые межиндивидуальные различия в характере связывания mAb против АПФ, мы представили результаты как отношение преципитации АПФ любым mAb (нормализованное для связывания mAb 9B9 с АПФ, соответствующего уровню фермента в плазме крови). ) для определенного донора к среднему значению преципитации ACE этим mAb для ряда доноров (фиг. 7B, 7D и 7E).Конформационный отпечаток АПФ крови в целом является очень стабильной характеристикой фермента, поскольку характер связывания mAb с АПФ из пула из 3 образцов плазмы довольно хорошо совпадал с образцом, полученным для пула из 80 других образцов плазмы (рис. 7F). Этот анализ также не выявил каких-либо специфических АПФ в крови почти всех пациентов, например пациентов № 5 и № L (рис. 7B и 7D), но показал, что конформационный отпечаток АПФ в крови пациента № I отличался от такового для других пациентов. доноры (рис. 7E).Более того, если сравнивать конформационные отпечатки пальцев в парах с большим количеством образцов, можно также уловить некоторые различия в конформации АПФ между индивидуумами. Таким образом, мы выявили такую ​​разницу для ACE от пациента № 5 и пациента № 14 (рис. 7C), вероятно, отражая небольшие межиндивидуальные различия в ACE из крови разных доноров.

Следует подчеркнуть, что влияние ингибиторов АПФ на связывание моноклональных антител (т.е. конформационные изменения в АПФ) было намного более выраженным при увеличении связывания mAb 1G12 / 6A12 до 4 раз (рис. 6C и 6D), чем межиндивидуальные различия в конформации АПФ, которые в наших экспериментах не превышали 30–40%.Тем не менее, наблюдаемые межиндивидуальные различия были статистически значимыми (p <0,05) и надежными. Хотя клиническая значимость таких межиндивидуальных различий требует дальнейшего изучения, однако это может привести к различному поведению фермента в некоторых физиологических процессах, например. те, которые включают АПФ, взаимодействуют с эффекторами [7, 8] в крови и тканях.

Конформационный отпечаток тканевого АПФ от разных доноров

Межиндивидуальные различия в конформации АПФ более заметны для тканевых АПФ.В качестве примера мы показываем конформационные отпечатки пальцев сердца и легких ACE от разных доноров (рис. 8). Ранее мы продемонстрировали, что конформационный отпечаток АПФ очень тканеспецифичен [9–10, 12], а характер связывания mAb с АПФ из сердца (9 образцов от разных доноров) заметно отличается от образца, полученного для АПФ из легких. образцы от тех же доноров. Однако, если сравнить конформационные отпечатки ACE с использованием большего количества образцов, можно найти некоторые различия в топографии поверхности ACE между людьми, как, например, для донора № 13 (Рис. 8B и 8F) и других доноров.Кроме того; эти различия могут быть тканеспецифичными, как видно для сердечных и легочных АПФ (рис. 8).

Рис. 8. Сравнительное связывание mAb с АПФ из разных тканей.

Конформационный фингерпринт АПФ в гомогенатах тканей сердца и легких от разных доноров с набором mAb к АПФ. А-Д . Отношение иммунопреципитированной активности АПФ из гомогената сердца 11 ^-го , 13 ^-го , 14 ^-го и 21 ^-го донора к таковому для других трех доноров. Е-Н . Отношение иммунопреципитированной активности АПФ из гомогената легких 11 ^-го , 13 ^-го , 14 ^-го и 21 ^-го донора к таковому для других трех доноров. Данные нормализованы, как показано в легенде к фиг. 7 (для осадков 9B9), отношения выражены в% и представлены как среднее значение по меньшей мере 3 независимых экспериментов. Н / Т — не проверенные моноклональные антитела. Раскраска такая же, как в легенде к рис. 3.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0209861.g008

Конформационные отпечатки пальцев АПФ из тканей другого донора, донора № 27, выявили значительное снижение связывания двух mAb, 1B8 и 3F10 (фиг.9), которое наблюдалось при попарном сравнении конформационных отпечатков АПФ (фиг. 9A – 9C), а также при сравнении конформационного отпечатка пальца донора № 27 со средним значением от двух других доноров (рис. 9D). Поскольку различия в связывании 1B8 / 3F10 были обнаружены для АПФ из разных тканей, сердца и легких, мы заподозрили мутацию в АПФ в перекрывающейся области эпитопов для mAb 1B8 / 3F10.Однако, когда мы секвенировали 9 экзонов С-домена, который кодировал перекрывающуюся область эпитопов для mAb 1B8 и 3F10 [29], мы не обнаружили мутации ACE, которая могла бы быть ответственной за этот фенотип. Более того, мы не идентифицировали какие-либо известные полиморфные варианты гена АПФ у пациента № 27, но в то же время мы идентифицировали молчащий однонуклеотидный полиморфизм rs4331 в гетерозиготном состоянии (AG) у пациента № 11, который не приводит к амино- кислотное замещение, но может быть связано с более высокой активностью АПФ [30].

Рис. 9. Межиндивидуальные различия в строении ACE сердца и легких.

Для ясности показаны отношения между активностью осажденного АПФ из любого гомогената ткани и активностью осажденного АПФ из другого гомогената. А . Отношение осажденной активности АПФ из гомогената легких 27 ^{-го донора} к активности 17 ^-го донора. Б . Отношение осажденной активности АПФ от гомогената сердца 27 ^{-го донора} к активности 17 ^-го донора. С . Отношение осажденной активности АПФ от гомогената сердца 27 ^{-го донора} к активности 11 ^-го донора. Д . Отношение осажденной активности АПФ от гомогената сердца 27 ^{-го донора} к таковой для среднего от 17 ^-го и 11 ^-го донора. Данные выражены в% и представлены как среднее значение не менее 3 независимых экспериментов. Н / Т — не проверенные моноклональные антитела. Раскраска такая же, как в легенде к рис. 3.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0209861.g009

Стоит отметить, что тканевые и клеточно-специфические посттрансляционные модификации (PTM) являются общими для различных белков [31–32], которые могут тонко или резко изменять белок топография поверхности. Наиболее распространенным ПТМ является гликозилирование. О межиндивидуальной гетерогенности N-гликома уже сообщалось, по крайней мере, для плазмы [33–34]. Следовательно, возможно, что мутация в одном из генов (из более чем 100 генов), ответственных за гликозилирование белков у человека [35], является причиной увеличения 1B8 / 3F10 до АПФ у пациента № 27.

Соматический АПФ представляет собой гликопротеин N-типа, характеризующийся значительным содержанием сахарной составляющей, например, АПФ почек человека, как сообщается, содержит около 18% сахаров [36]. Последовательность соматического АПФ человека содержит 17 потенциальных сайтов для N-гликозилирования [3], однако информация о структуре и точном положении гликановых цепей в АПФ из разных тканей очень ограничена [10, 12, 37–38]. Основная часть гликанов в соматическом АПФ принадлежит олигосахаридам двухантенного комплексного типа, а также высокоманнозным и гибридным олигосахаридам [39].Эти типы олигосахаридов обладают наибольшим структурным разнообразием из-за различного количества внешних цепей, связанных с триманнозильным ядром, и различных структур этих цепей. Кроме того, внешние цепи могут нести на своих концах разное количество остатков нейраминовой кислоты.

Почти все конформационные эпитопы для mAb, которые мы создали для каталитически активного ACE легких человека, содержат потенциальные сайты гликозилирования [5]. В частности, эпитопы для mAb 1B8 и 3F10 содержат сайт гликозилирования Asn731 [29].Следовательно, мы можем ожидать, что это гликан в сайте гликозилирования Asn731, который отличается по АПФ от донора № 27, в то время как мы не можем также исключить другой ПТМ для этого донора на данный момент.

Кроме того, анализ характера связывания набора mAb с АПФ из разных тканей и клеток может предоставить некоторую информацию о различиях в гликозилировании АПФ в этих тканях [5, 9–10, 12], в частности, в сиалилировании определенные гликаны. Фиг. 10A демонстрирует различия в паттернах связывания mAb с ACE, очищенными из гомогената легкого и из плазмы крови, т.е.е., различия в топографии локальной поверхности АПФ из разных источников. АПФ в плазме происходит в основном из капилляров легких (на 75%, по нашей оценке [неопубликовано]) на основе гетерогенной экспрессии АПФ в капиллярах различных органов [40]. Известно, что гликопротеины с дефицитом сиаловой кислоты могут быть выборочно удалены из сыворотки макрофагами и гепатоцитами в печени с помощью лектинов, специфически распознающих предпоследние остатки галактозы в олигосахаридных цепях гликопротеина [41].Например, АПФ из кроличьей сыворотки содержит в 3 раза более высокое молярное соотношение сиалильных и галактозильных остатков, чем АПФ легких [42]. Следовательно, более высокое связывание mAb i1A8 и 5F1 и гораздо более низкое связывание mAb 1B8 и 3F10 с ACE легких по сравнению с ACE плазмы (фиг. 10A) можно объяснить различным сиалированием олигосахаридных цепей, присутствующих в эпитопах соответствующих mAb. В частности, можно сделать вывод, что mAb 1B8 и 3F10 к C-домену ACE намного лучше связываются с ферментом, когда гликан в потенциальном сайте гликозилирования Asn731 сиалилирован.Менее эффективное связывание mAb 1B8 и 3F10 с АПФ от донора № 27, следовательно, указывает на меньшую степень сиалирования (или даже отсутствие остатков сиаловой кислоты) этого конкретного гликана в сайте гликозилирования Asn731 в АПФ от этого донора по сравнению с АПФ. от других доноров. Таким образом, конформационный отпечаток пальца может помочь выявить некоторые тонкие характеристики фермента у определенного человека.

Рис. 10. Влияние очистки на связывание mAb с различными ACE.

АПФ в любой паре тестируемых источников АПФ уравновешивали ZPHL в качестве субстрата, и осаждение активности АПФ проводили, как показано на фиг.3. А . Отношение осажденной активности чистого АПФ легких к активности чистого АПФ плазмы. Б . Влияние очистки АПФ из плазмы человека на связывание mAb. C Влияние очистки ACE из гомогената сердца человека (1: 9, ткань: буфер) на связывание mAb. Д . Влияние очистки АПФ из гомогената легких человека (1: 9, ткань: буфер) на связывание mAb. Отношения выражены в% и представлены как среднее значение не менее 3 независимых экспериментов. Н / Т — не проверенные моноклональные антитела.Раскраска такая же, как в легенде к рис. 3.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0209861.g010

Кроме того, из тех же данных (рис. 10A) видно, что mAb 1E10 к домену C ACE и mAb 5F1 и i1A8 к домену N. лучше связываются с ферментом, когда олигосахаридные цепи в соответствующих сайтах гликозилирования, Asn666, Asn117 и Asn82, соответственно, не сиалилированы или, по крайней мере, в меньшей степени сиалированы. Это открытие может быть дополнительно экстраполировано на анализ конформационных отпечатков ACE от других доноров.

Обнаружение эффекторов АПФ в гомогенатах крови и тканей

Конформационный фингерпринт АПФ также может предоставить ценную информацию о предполагаемых эффекторах АПФ и АПФ-связывающих белках в крови или различных тканях. Влияние этих эффекторов на доступ эпитопов на поверхности АПФ для mAb видно из сравнения конформационных отпечатков АПФ, очищенных из гомогената легких и сердца и из плазмы человека (фиг. 10). Очистка ACE из плазмы человека привела к увеличению связывания четырех mAb (и уменьшению одного mAb) с доменом N и одного mAb с доменом C (фиг. 10A).Очистка ACE из сердца человека снижает связывание пяти mAb с N-доменом, в то время как одно mAb с N-доменом и пять mAb с C-доменом увеличивают их связывание (фиг. 10B). Очистка АПФ из легких снижает связывание 3 мАт с доменом N и увеличивает связывание 5 мАт с доменом С (фиг. 10С).

Из предыдущих исследований мы знаем, что обычные ингибиторы АПФ, когда они связываются с АПФ, значительно увеличивают связывание двух mAb, 1G12 и 6A12, с N-доменом и уменьшают связывание двух антикаталитических mAb, 1E10 и 4E3, с C домен АПФ [6–8, 29].Таким образом, снижение связывания mAb 1G12 / 6A12 и увеличение связывания mAb 1E10 / 4E3 с сердечными и легочными АПФ можно отнести, по крайней мере частично, к удалению некоторых эндогенных ингибиторов АПФ, сопровождающих АПФ в сердце. и легкие в результате очистки АПФ. Однако значительное увеличение связывания mAb 1B3, 1B8 и 3F10 нельзя объяснить только удалением ингибиторов АПФ, а скорее удалением некоторых других эффекторов АПФ / связывающих АПФ белков, сопровождающих АПФ в сердце и легких, и экранирующих (маскирующих) эпитопов. для мАт 1B3, 1B8 / 3F10, 1E10 / 4E3.

Совершенно иной эффект очистки фермента на его конформационный отпечаток был получен для плазменного АПФ. А именно, очистка АПФ из плазмы человека привела к резкому увеличению связывания 4 мАт с перекрывающейся областью в N-домене, 1G12 / 6A12 / i2H5 [6] и 3G8 [20], что мы должны объяснить в основном диссоциацией билирубина из его комплекса с АПФ плазмы в результате очистки фермента, поскольку мы показали, что билирубин резко снижает связывание этих самых mAb [8].Повышение связывания mAb 1E10 с С-доменом АПФ плазмы после очистки можно объяснить либо диссоциацией эндогенных ингибиторов, либо / и диссоциацией лизоцима, который образует комплексы с АПФ путем связывания с щелью между доменами АПФ и с областью 1E10. эпитоп [8].

Таким образом, конформационный фингерпринт АПФ в различных тканях человека (с использованием набора mAb к различным эпитопам человеческого АПФ) предоставляет новую структурную информацию о характеристиках АПФ у разных людей (и в разных тканях), а также его эффекторах, это могло быть клинически важным.

СНИЖЕНИЕ РЕДОКС-ПОТЕНЦИАЛА И ГИПЕРПРОДУКЦИЯ СУПЕРОКСИДА АНИОНА В КРОВИ ПРЕДСКАЗЫВАЕТСЯ СЕРДЕЧНАЯ АРРИТМИЯ ПОСЛЕ ПРЯМОЙ ХИРУРГИЧЕСКОЙ РЕВАСКУЛЯРИЗАЦИИ МИОКАРДА — Ковалев

Абстрактные

Целью исследования являлась оценка прогностической ценности снижения окислительно-восстановительного потенциала и гиперпродукции супероксид-аниона в плазме со снижением общего пула пиридиновых нуклеотидов или без него при внутрибольничных осложнениях после прямой хирургической реваскуляризации миокарда.В многоцентровое проспективное исследование были включены 303 пациента (248 мужчин и 48 женщин), средний возраст 58,6 ± 6,8 лет с диагнозом ишемическая болезнь сердца и синусовый ритм без выраженной дисфункции левого желудочка, перенесших операцию коронарного шунтирования. Были рассчитаны показатели Европейской системы оценки кардиологического риска (EuroScore) и показатели заболеваемости ишемическим инсультом после процедуры по шкале CHADS2 и CHA2DS2-VASc. Общий пул пиридиновых нуклеотидов, окислительно-восстановительный потенциал, гиперпродукция супероксид-аниона и активность НАДФН-оксидазы в плазме крови определяли до и через год после операции на сердце.Для статистического анализа использовали SPSS версии 23.0 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс), все переменные выражены как среднее ± стандартное отклонение (SD). Максимум появления послеоперационной фибрилляции предсердий (ФПП) развился у 34% пациентов через 1-2 дня после кардиохирургического вмешательства. В когорте пациентов с ФПНП, осложненной снижением окислительно-восстановительного потенциала НАД / НАДН на 23% (р

Об авторах

Сергей А.Ковалев

Электронная почта: [email protected]
доктор медицинских наук, заведующий отделением кардиохирургии № 2 Воронежской областной государственной клинической больницы № 1, г. Воронеж, Российская Федерация; Воронеж Н.Н. Государственная медицинская академия им. Бурденко, Воронеж, Российская Федерация 394036, Воронеж, Российская Федерация

Iu.М Чубирко

394066, Воронеж, Российская Федерация 394036, Воронеж, Российская Федерация

Вериковский В.А.

394066, Воронеж, Российская Федерация

В.Е Маликов

121552, Москва, Российская Федерация

М.А Арзуманян

121552, Москва, Российская Федерация

г.В Сукоян

109382, Москва, Российская Федерация

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Разрушение мифов, подтверждение доказательств и прояснение заблуждений

По мере того, как мир ищет панацею от COVID-19, лечение пациентов плазмой, взятой у тех, кто выздоровел от вируса, рекламируется как возможное лекарство, но, по мнению ученых, все еще остаются большие проблемы .

Прошли месяцы с тех пор, как новый коронавирус начал свирепствовать по всему Китаю, распространившись на другие страны и заразив более миллиона человек по всему миру, но до сих пор нет клинически протестированной вакцины или лекарств.

Однако одно возможное лечение, которое существует уже более века, привлекает внимание, и некоторые ученые предполагают, что он может изменить правила игры — при условии, что определенные недостатки будут устранены.

Подход в основном вращается вокруг выздоравливающей плазмы, желтоватого жидкого компонента человеческой крови, у кого-то, кто выздоровел от вирусной инфекции, и переливания ее недавно инфицированному пациенту.

Плазма здесь важна, потому что она богата антителами — белками, которые связываются с частями вируса и нейтрализуют его. Примечательно, что антитела вырабатываются против определенных типов вирусов, которые по сути становятся «антивирусной сывороткой», — пояснил RT заведующий отделением переливания крови Центра сердечно-сосудистой хирургии им. Бакулева Алексей Купряшов.

Более того, плазма более полезна, чем сама кровь, «потому что вам не нужно заботиться о группе крови», — пояснил Сергей Нетесов, ведущий вирусолог, член Российской академии наук.

больниц в США, которые отчаянно пытаются помочь очень больным пациентам с COVID-19, очень заразным респираторным заболеванием, вызванным новым коронавирусом, пробуют лечение, впервые примененное в 1890-х годах, которое основывается на плазме крови, сданной выздоровевшими пациентами. https://t.co/MxqWannKeN

— Ridgewood Times (@ridgewoodtimes) 5 апреля 2020 г.

Идея терапии очень проста — совместное использование антител, взятых у пациентов с устойчивой иммунной системой, может помочь другим, более слабым, выздороветь.

Разработанный немецким физиологом Эмилем фон Берингом — первым лауреатом Нобелевской премии по медицине — метод существует уже более века.

Совсем недавно, в середине марта, Артуро Касадеваль из Школы общественного здравоохранения Джона Хопкинса и Лизе-анн Пирофски из Медицинского колледжа Альберта Эйнштейна отстаивали лечение, утверждая, что введение антител потенциально может защитить людей от вируса на несколько недель.

Позже в том же месяце их китайские коллеги предположили, что выздоравливающая плазма помогла пациентам с Covid-19 даже на вентиляции, но их исследование было основано только на пяти случаях.

Как говорили медицинские работники в Клятве Гиппократа, не причинять вреда — это ключ к медицине. Можем ли мы быть уверены, что лечение пациентов с Covid-19 плазмой, содержащей антитела, не принесет вреда?

«Мы переливаем сотни тысяч [или] миллионов единиц крови в больницах, и тяжелые исходы действительно низки», — сказал RT профессор Джефф Бейли из Университета Брауна в США.

Логика использования плазмы против Covid-19 «очень сильна», потому что «выздоровевший человек имеет хорошие антитела, которые блокируют и нейтрализуют вирус», — пояснил он.Однако одна большая проблема заключается в том, что «это новое заболевание, мы не много переливали».

Что вы хотите знать, так это то, что если это помогает выжить [на] 50 процентов, а что-то еще помогает выживанию [на] 25 процентов, вы, вероятно, захотите выбрать тот, который дает 50 процентов.

Другая проблема, которая может возникнуть, заключается в том, что каждые 200 или 400 миллилитров переливаемой плазмы расширяют кровоток пациента.

Это не представляет проблемы, если почки пациента работают хорошо, но если они не работают, объем жидкости в легких может увеличиться, что ухудшит состояние.

Но будет ли терапия работать для всех, учитывая, что нет убедительных статистических данных, показывающих, эффективно ли переливание плазмы против Covid-19?

Подробнее: Женщины должны быть защищены во время изоляции от вирусов: призывает Генеральный секретарь ООН

«Вы должны попробовать, только эксперименты могут сказать нам« да »или« нет », — утверждает российский вирусолог Нетесов. В любом случае попробовать экспериментальную терапию лучше, чем «умереть на месте без лекарств».

Врачам, находящимся на переднем крае, срочно нужны испытания для изучения преимуществ лечения плазмой, поскольку разрабатываются новые лекарства, согласился Бейли.

Однако самая сложная часть здесь — это поиск и проверка доноров, число которых ужасно мало, особенно по сравнению с более чем одним миллионом случаев коронавируса во всем мире.

Кроме того, плазма, предназначенная для пациентов с Covid-19, не должна быть заражена другими заболеваниями, такими как гепатит или ВИЧ / СПИД.

«Фактически, до 50 процентов донорской крови не принимается в большинстве стран», — сообщил Нетесов, ссылаясь на пример Китая — пионера в области плазменной терапии — где почти каждый десятый потенциальный донор болел гепатитом.

В России, например, лишь крошечное количество выздоровевших пациентов с Covid-19, и, возможно, только половина из них могла сдавать кровь, ограничивая количество всего несколькими десятками, признал ученый.

«Число больных все равно больше, чем число выздоровевших. Пока такая ситуация сохраняется, нам не у кого брать эту плазму », — согласился Купряшов из Центра Бакулева.

Врачи по всему миру стирают пыль вековой давности от лечения инфекций: инфузии плазмы крови, изобилующей иммунными молекулами, которые помогли выжившим победить новый коронавирус.https://t.co/zQP9L1IvhP

— Star-Herald (@sbstarherald) 4 апреля 2020 г.

Выбор правильной дозировки плазмы не менее важен в данных обстоятельствах, потому что врачи должны знать, какой концентрации антител достаточно, чтобы помочь справиться с вирусом.

Однако в долгосрочной перспективе производители обычно перерабатывают плазму, увеличивая количество антител и позволяя врачам использовать меньшие дозы, сказал Бейли.

Органы здравоохранения во всем мире возлагают большие надежды на плазменную обработку, быстрое развертывание испытаний и разрешение на ее использование в сострадательных целях, позволяя назначать неутвержденные методы лечения, если у умирающего пациента нет других вариантов и если потенциальные выгоды перевешивают риски.

В США, где число случаев коронавируса в настоящее время превысило 312 000, Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) возглавило «новые национальные усилия» по облегчению использования лечения плазмой.

Подробнее: Ситуация ухудшается !? Премьер-министр Великобритании Джонсон доставлен в больницу

«Имеются некоторые ограниченные данные, позволяющие предположить, что плазма выздоравливающих и гипериммунный глобулин могут иметь преимущества при болезни Covid-19», — заявляет агентство.

Клиника Мэйо будет ведущим учреждением программы, а Красный Крест Америки будет собирать плазму и распределять ее по больницам по всей стране.

В Великобритании пациенты с коронавирусом вот-вот получат экспериментальное лечение, и эксперты призывают Национальную службу здравоохранения срочно создать запасы плазмы, богатой антителами, для таких нужд. Франция также собирается начать испытания многообещающей терапии в следующий вторник.

Россия тоже догоняет эту тенденцию. По сообщениям местных СМИ, знаменитый институт неотложной помощи им. Склифосовского первым в ближайшие дни попробует ввести плазму.

Кроме того, Институт вектора — ведущий исследовательский центр вирусологии и биотехнологии — разработал тест для измерения антител у тех, кто пережил Covid-19.Как сообщила вице-премьер Татьяна Голикова, учреждение уже провело анализ крови 11 человек, выздоровевших от вируса.

Иран, который недавно стал горячей точкой коронавируса, также последует этому примеру, как и Турция, где глава Красного Полумесяца настаивает, что он может стать «одним из самых эффективных приложений в мире» против заражения.

В настоящее время международное медицинское сообщество рассматривает множество других вариантов лечения, от противомалярийных препаратов до лекарств от ВИЧ.

Также разрабатывается ряд вакцин против Covid-19, хотя до ввода в эксплуатацию, похоже, остались месяцы, если не годы.

RT с дополнительной информацией от GVS News Desk.

Азотистая кислота — обзор

СИНТЕЗ И ОБНАРУЖЕНИЕ

Самый простой путь синтеза нитрозотиолов S — это через равновесие с азотистой кислотой, полученное подкислением раствора. нитрита [16,17].

(1) RSH + HNO2undefined⇌ RSNO + h3O

Типичный запас CySNO получают путем добавления эквимолярных количеств (около 50 мМ) CySH и нитрита натрия к 0,1 М HCl. Реакция довольно быстрая и требует менее минуты. Кинетику образования CysNO при различных pH можно увидеть на фиг. 3. Продукты реакции всегда представляют собой смесь CysNO и дисульфидов, причем относительный баланс сильно зависит от pH (см. Таблицу 2). При физиологическом pH преобладает дисульфид, но при pH ~ 1 выход CysNO составляет почти 100%.При pH, близком к 1, превращение Cys в CysNO завершается в течение минуты при 37 ° C, при комнатной температуре — в течение нескольких минут.

Рис. 3. Кинетика образования CysNO в результате кислотного восстановления нитрита, измеренная по оптическому поглощению при 543 нМ в буферных растворах. Начальные концентрации составляли 40 мМ CysH и 40 мМ нитрита. Температура была 37 ° C.

Таблица 2. Выходы CysNO и цистина, полученные в реакционной смеси 0,04 M CysH с 0,04 M NaNO ₂ в водных буферах при 37 ° C.Выходы показывают, что весь цистеин включен либо в нитрозотиол S , либо в дисульфид цистина.

Данные адаптированы из Ref. [18]

Поскольку S -нитрозотиолы склонны к фотолизу и термолизу, реакция должна протекать в темном и прохладном месте. Об образовании CysNO и GSNO свидетельствует его интенсивный розовый цвет. Образование небольших пузырьков газа со временем указывает на утечку определенного количества газа NO, и конечный выход следует проверить спектрофотометрически непосредственно перед использованием. Исходные растворы лучше всего готовить свежеприготовленными, и их нельзя хранить в жидкой форме более нескольких часов.В замороженном состоянии возможно хранение до недели, но более длительное хранение возможно только для охлажденных кристаллических GSNO или CysNO (розовые порошки).

Следует отметить, что эквимолярная смесь тиола и нитрита всегда оставляет некоторое количество остаточного депротонированного тиола в растворе. Это справедливо для синтеза любого типа RSNO. Присутствие определенного количества RS ^— в анализах с RSNO очень важно из-за его способности уменьшать паразитные ионы меди в растворе

(2) Cu2 + undefined + RS − undefined → Cu + + RS •

Эта реакция приводит к тиильным радикалам и небольшому количеству одновалентной меди Cu ⁺ .Последний является эффективным катализатором разложения RSNO ( см. Ниже, ), и путь ложной меди часто приводит к появлению артефактов. Этой проблемы можно избежать, подавляя окислительно-восстановительную способность ионов меди хелаторами, такими как ЭДТА или неокупроин.

Хотя реакция Ур. (1) известен давно, его молекулярный механизм до сих пор полностью не изучен. Недавние сообщения [18] показали, что основным нитрозирующим веществом при низких значениях pH <3,5 является нитрозоний NO ⁺ , и реакция протекает быстро.При более высоком pH высвобождение нитрозония блокируется, и N ₂ O ₃ выступает в качестве основного нитрозирующего вещества в реакции

GSH + N2O3undefined → GSNO + NO2 − undefined + H +

Это нитрозирование N ₂ O ₃ очень быстро со скоростью второго порядка k = 6.6 × 10 ⁷ (Ms) ⁻¹ [19]. Скорость образования N ₂ O ₃ намного ниже (см. Главу 1) и действует как ступень ограничения скорости.

Интересно, что сам радикал NO не проявляет значительной реакционной способности по отношению к сульфгидрильной группе в анаэробных условиях [20–22].Иначе говоря, NO не является нитрозирующим соединением S сам по себе в отсутствие кислорода. Вместо этого реакция NO с тиолами приводит к образованию дисульфидов RS-SR [23–25]

(3) RSH + NO → RS − N − Oh3RS − N − OH → RS − SR + HONNOH → RS − SR + N2O + h3ORS − N − OH + NO → RSOH + N2ORSOH + RSH → RS − SR + h3O

Следует отметить, что эта последовательность реакций зависит от pH, поскольку тиолат-анион проявляет гораздо более высокую реакционную способность, чем протонированный тиол. Для [NO] «[GSH] последовательность (3), как сообщалось [25], имеет очевидную скорость реакции второго порядка, равную 0.080 ± 0,008 (Ms) ^-1 (37 ° C, pH 7,4). Таблица 1 показывает, что физиологический [GSH] ~ 1 мМ. При этой концентрации реакция (3) даст радикалам NO время жизни около 10 ⁴ с. Следовательно, маловероятно, что аноксическая реакция (3) вызовет значительную потерю NO in vivo .

В этом контексте важно отметить, что константа кислотной диссоциации pK _a тиолов сильно варьируется в зависимости от функционализации остатков цистеина. Тиолатный фрагмент свободного цистеина имеет pK _a = 8.3. В глутатионе константа остатка цистеина была увеличена до pK _a = 8,7. Константа резко снижена для остатков цистеина многих белков, таких как протеинтирозинфосфатаза (PTP1) с pK _a ~ 5,4 или протеин-дисульфид-изомераза с pK _a ~ 3,5. Это большое изменение константы диссоциации подразумевает большое изменение баланса между депротонированными / протонированными формами сульфгидрильной группы с сопутствующим влиянием на скорости реакции и выходы S-нитрозирования.

Так как же S -нитрозотиолы образуются in vivo? Сообщалось об умеренном высвобождении RSNO в результате каталитического действия церулоплазмина и самого NOS [26], но мощные ферментативные пути S-нитрозирования, по-видимому, до сих пор не идентифицированы [2]. Это предполагает, что неферментативные пути доминируют над in vivo и . Превращение RSH в RSNO требует появления S-нитрозирующих промежуточных продуктов, таких как нитрозоний NO ⁺ , NO ₂ или N ₂ O ₃ .Пути реакции образования этих форм из свободного NO обсуждались в главе 1. Хотя реакции хорошо изучены in vitro , остается значительная неопределенность в отношении доминирующего механизма S-нитрозирования сульфгидрилов in vivo [22]. , 27]. Через каким путем S-нитрозосоединения появляются в живой ткани? На этот вопрос нельзя ответить, не отметив, что S -нитрозотиолы образуют только один класс нитрозосоединений, который тесно связан с другими пулами посредством медленных химических равновесий.

Эксперименты in vitro показывают, что аэробные смеси NO / GSH или GSNO / GSH выделяют определенное количество высокореактивных форм кислорода (ROS). Высвобождение свободных АФК проявлялось в значительном разрыве цепи ДНК и защите от разрыва цепи акцепторами, такими как каталаза и супероксиддисмутаза (СОД) [28]. Механизмы реакции до сих пор остаются спорными. Механизм S-нитрозирования, включающий восстановление O ₂ до супероксида O2-, был предложен и подтвержден in vitro [29]:

(4) RSH + NO → RS − N − OHRS − N − OH + O2 → RS − NO + O2− + H + O2− + NO → ONOO−

В этом механизме не используются следовые ионы металлов.Однако известно, что такие следовые ионы металлов ускоряют как образование, так и разложение S -нитрозотиолов in vitro [30] и in vivo , возможно, катализируя образование нитрозирующих частиц, таких как NO ⁺ , NO _2. или N ₂ O ₃ от NO в присутствии кислорода. Это делает маловероятным, что механизм, подобный уравнению. (4) быть доминирующим путем образования S -нитрозотиолов in vivo . Было замечено, что некоторые ферменты, такие как церулоплазмин и сам NOS, катализируют образование нитрозотиолов S [26], но выходы остаются низкими.В качестве альтернативы известно, что динитрозильные комплексы железа (ДНКЖ) участвуют в сложном реакционном равновесии между тиолами, NO и S -нитрозотиолами. Это равновесие подробно обсуждается в главе 11 этой книги. In vitro эксперименты подтвердили, что присутствие железа индуцирует образование RSNO из NO через промежуточную ДНК даже в бескислородных условиях [31]. Интересно, что образование небольших количеств ДНКЖ из эндогенного железа было обнаружено во многих биологических системах после воздействия экзогенного NO или после стимуляции выработки эндогенного NO.Сообщалось о многих примерах от клеточных культур до тканей растений и животных. Однако убедительных доказательств физиологической значимости этого пути ДНКЖ до сих пор нет.

Из вышесказанного ясно, что тиолы участвуют во многих путях реакции с эндогенными реагентами, такими как кислород или различные оксиды азота. Относительная важность этих путей определяется соответствующей скоростью реакции. Полезная подборка скоростей реакции для глутатиона была собрана в работе.[32].

Обнаружение и количественное определение нитрозотиолов S представляет собой серьезную проблему для биологических систем. Специальные методы для S-нитрозированных белков были недавно рассмотрены в томе 396 из Methods in Enzymology . Широко используемым методом является гомолитический разрыв связи S – NO медью / йодидом и обнаружение газообразного NO с помощью хемилюминесценции с помощью анализатора озона. В качестве альтернативы, NO может быть обнаружен электрохимически с помощью NO-электрода или путем захвата спина с помощью электронного парамагнитного резонанса (см. Главу 18).Селективность по высокой или низкой молекулярной массе может быть получена посредством фильтрации с помощью ультрафильтрационных мембран [4] или высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Фотолиз-хемилюминесцентная спектроскопия [33] — чувствительный метод анализа смесей нитрозотиолов S . Он состоит из инструментального каскада, включающего насос ВЭЖХ, камеру для фотолиза и хемилюминесцентный спектрометр или анализатор озона. Метод работает путем гомолитического разрыва связи S – NO путем облучения в камере фотолиза с последующим обнаружением и количественным определением выходящего газообразного NO с помощью анализатора озона.

Альтернативные методы основаны на флуоресцентном детектировании продуктов разложения S -нитрозотиола. В реакции Сэвилля [34] хлорид ртути используется для катализирования высвобождения свободного NO и последующего улавливания 2,7-дихлорфлуоресцеином (DCF) или 2,3-диаминонафталином (DAN). Детектирование флуоресценции очень чувствительно, но специфичность детектирования снижается из-за артефактов и самозванцев для истинного NO [35].

В заключение этого раздела следует отметить, что реакция S-нитрозирования в сложной биологической системе может протекать значительно иначе, чем в гомогенной водной фазе, такой как буферный раствор.Сосуществование гидрофобных и гидрофильных компартментов в клетках, тканях и даже отдельных белках может изменять реакции, известные в воде. Основная причина — тенденция нейтральных частиц, таких как NO, O2 и N2O3, накапливаться в гидрофобных отсеках, таких как мембранная фракция [26,36] или гидрофобные карманы белков. Этот эффект может способствовать S-нитрозированию цистеина β ₉₃ гемоглобина, который находится в гидрофобной области белка [32]. Кроме того, было установлено, что присутствие соседних аминокислот влияет на скорость S-нитрозилирования, изменяя полярность и эффективную кислотность вблизи остатка цистеина [2].Было показано, что наличие липидного компартмента ускоряет окисление NO O2 на порядки [36].

Саратовская осенняя встреча 2020: Оптические и нанотехнологии для биологии и медицины | (2021 год) | Публикации

Показать аннотацию

Обнаружение эндогенной флуоресценции неопластических тканей может стать чувствительным дополнительным инструментом для раннего и точного обнаружения различных опухолей в мягких тканях. Эндоскопические методы и волоконно-оптические флуоресцентные датчики позволяют охватить все органы и места человеческого тела.Новые источники светового возбуждения и чувствительные детекторы с высоким спектральным разрешением позволяют детектировать низкоинтенсивную автофлуоресценцию или различать сигналы специфических флуоресцентных маркеров, накопленных в опухолевых клетках. Наиболее важным моментом в текущем развитии метода стационарной флуоресценции для диагностических приложений в онкологической практике является создание соответствующих баз данных с информацией о флуоресцентных свойствах различных типов патологий для каждого органа и типа биологической ткани.Необходимо оценить влияние клеточной среды и состояния, наличие различных внутренних хромофоров и пигментов, которые могут искажать обнаруженные эмиссионные сигналы. С диагностической точки зрения, информация о различных подтипах опухолей, состоянии роста, диспластических и доброкачественных формах поражения должна накапливаться и использоваться для дифференциального анализа во время первичных клинических наблюдений. В этом отчете будет представлен опыт эндогенного флуоресцентного обнаружения на основе разработки матрицы возбуждения-излучения (EEM) и синхронной флуоресцентной спектроскопии (SFS) опухолей нижних отделов желудочно-кишечного тракта.Злокачественные поражения толстой и прямой кишки были обнаружены и дифференцированы от нормальной слизистой оболочки в широком спектральном диапазоне (возбуждение при 280-440 нм, эмиссия при 300-800 нм) по выявленным автофлуоресцентным свойствам.

Показать аннотацию

Визуализация медленных деформаций в биологических тканях может способствовать изучению и выявлению многих сложных процессов, таких как течение жидкости, рост и релаксация механических напряжений, образование межклеточных пор, вызванных приложением внешней силы.Здесь представлен новый метод картирования деформации, основанный на анализе комплексного ОКТ-сигнала для визуализации хряща в реальном времени. Модифицируют хрящевую ткань лазерным излучением, иммерсионным глицерином и сушкой на воздухе. Проанализирована эволюция деформации, вызванной модифицирующими эффектами. Для режима неравновесной диффузии показано, что ткань испытывает интенсивные знакопеременные деформации с амплитудами до 0,4. Обнаруживается обширное обезвоживание в пределах 1 мм толщины ткани и выраженная приповерхностная припухлость.Сравниваются штаммы, вызванные осмотической дегидратацией и обезвоживанием воздуха.

Показать аннотацию

В недавней статье (J. Colloid Interface Sci. 578, 358 {365 (2020)) мы обсуждали влияние сопротивления Капицы на стабильность и эффективность фотоакустического преобразования из золотых наностержней, которое мы проиллюстрировали с помощью экспериментальной модели грубые частицы, демонстрирующие, по сравнению с их нормальным аналогом, большую удельную поверхность и, таким образом, более быстрое тепловое взаимодействие с их средой.Мы сообщили о поразительном улучшении обоих параметров, и мы предсказали больше направлений для модуляции эффективного значения сопротивления Капице и достижения технологического воздействия, а также новых приложений. Однако путь к синтезу необработанных золотых наностержней включает в себя несколько этапов и нестандартные параметры процесса, которые могли повлиять на их фотостабильность, что потенциально привело к переоценке роли шероховатости. Здесь мы оспариваем наши предыдущие выводы, выделяя и проверяя роль наиболее важных из этих факторов, таких как термический отжиг в мягких условиях и нанесение жертвенной оболочки из серебра для гальванической замены золотом.Тщательно проанализировав соответствующие пороговые значения, мы пришли к выводу, что оба метода лечения фактически не оказывают небольшого ускорения фотоповреждения золотых наностержней. Таким образом, наши новые результаты в совокупности подтверждают и даже подтверждают отнесение наших первоначальных результатов к оценке грубости.

Показать аннотацию

Многопараметрическая оптическая неинвазивная диагностика (МОНД), объединяющая несколько методов в одном приборе, является одной из наиболее перспективных технологий исследования тканевых систем микроциркуляции человека (МТС).Это позволяет получить высокоэффективные диагностические инструменты для ревматологии, эндокринологии, хирургии, онкологии, неврологии и других областей медицины, так как необходимо определение параметров перфузионно-метаболического статуса тканей. Однако существует ряд ограничений, связанных с его недостаточным методическим и инструментальным обеспечением. Настоящая работа посвящена систематизации взаимосвязи основных параметров и состояний МТС при различных заболеваниях и методам ОНД, а также разработке формализованной схемы синтеза методов МОНД.Цель заключалась в обосновании и разработке методологии mOND для оценки функционального состояния MTS человеческого организма и демонстрации примера реализации mOND в малоинвазивной хирургии. Результаты могут быть распространены на другие области медицины, например, для улучшения этих методов в ревматологии, эндокринологии, отоларингологии, дерматологии, неврологии и т. Д.

Показать аннотацию

Одним из перспективных подходов к лечению поврежденных тканей является применение методов биоинженерии, основанных на введении клеток в зону повреждения.Применение одних только клеток не обеспечивает полного замещения тканевого дефекта. Поэтому используются каркасы, позволяющие организовать клетки в структуру, способную к полному воспроизведению целостности поврежденной ткани. Известно множество факторов, влияющих на поведение клеток и формирование тканей в месте повреждения при использовании каркасов. Здесь мы проанализировали влияние структурной неоднородности каркасов на клеточное поведение и метаболизм. Все скаффолды были получены методом двухфотонной полимеризации.Оказалось, что заселение гетерогенных матриксов незначительно меньше, чем гомогенных. Однако мертвых клеток на гетерогенном матриксе не было. Мы обнаружили, что уровень свободного и связанного NAD (P) H для клеток на гетерогенном и гомогенном каркасе различается. Это может указывать на различный вклад интенсивности гликолиза и окислительного фосфорилирования в стволовых клетках, засеянных на два типа каркасов.

Показать аннотацию

Экспериментальное исследование ультразвуковых режимов выполнено на образцах кожи ex vivo белых крыс линии Вистар. Ультразвук был обеспечен системой Dynatron 125 US (Dynatronics, США) после нанесения на поверхность образца водного раствора спирто-фруктозы (20-30-50%) оптического очищающего средства.Были использованы три различных ультразвуковых режима, чтобы найти наиболее эффективную и быструю оптическую очистку. Система оптической когерентной томографии Spectral Radar OCT System OCP930SR 022 (Thorlabs Inc., США) с длиной волны 930 нм использовалась для получения количественных данных об эффективности и скорости оптического просветления кожи. Наилучший режим имел частоту 3 МГц и мощность 1,5 Вт в непрерывном режиме в течение 3 минут.

Показать аннотацию

Целью нашего исследования было оценить степень васкуляризации опухоли для прогнозирования эффективности плазмонной фототермической терапии (ФТТ) и фотодинамической терапии (ФДТ) у крыс-опухоленосителей.Перед любым лечением для оценки степени васкуляризации трансплантированной холангиокарциномы крысы использовали трехмерную допплеровскую ультразвуковую визуализацию. Для PPT использовались золотые наностержни с соотношением сторон 4: 1, функционализированные тиолированным полиэтиленгликолем. После нескольких фракционных внутривенных (IV) инъекций крысам с холангиокарциномой опухоли облучали через кожу 808-нм диодным лазером NIR при плотности мощности 2,3 Вт / см ² в течение 15 мин. Для ФДТ применяли галактозу-люфталоцианин в качестве фотосенсибилизатора внутриопухолевой инъекцией в дозе 2 мг / кг.Затем опухоли облучали через кожу диодным лазерным источником с длиной волны 670 нм и плотностью мощности 200 мВт / см. ² применяли в течение 1000 секунд в трех неперекрывающихся зонах, покрывающих всю поверхность опухоли, для получения общей дозы облучения 200 Дж / см. ² для каждого поражения. Вывод животных из эксперимента и забор тканей для морфологического исследования проводили до и через 72 часа после ФДТ и ФДТ. Микроплотность сосудов в опухолях оценивали на гистологических срезах как количество сосудов или площадь сосудов на единицу оцененной площади опухоли.Показано, что эффективность терапии ФПТ и ФДТ в большей степени обусловлена ​​достаточным накоплением фототермосенсибилизаторов в опухоли, поэтому перед началом терапии необходима предварительная оценка степени васкуляризации опухоли.

Показать аннотацию

В статье обсуждается экспериментальный этап создания прибора для бесконтактной оценки свертываемости крови с использованием метода лазерно-спекл-корреляции. Устройство, основанное на этом методе, будет иметь ряд преимуществ перед существующими анализаторами гемостаза: оно позволяет анализировать микропробу плазмы, цитратную и нативную кровь бесконтактным оптическим методом.Представлены и обсуждены результаты экспериментов с плазмой, цитратом и нативной кровью, направленных на практическое развитие метода. Показано, что метод лазерно-спекл-корреляции перспективен для создания нового прибора для оценки свертываемости крови.

Показать аннотацию

Ген «N» кодирует структурный белок нуклеокапсида вируса SARS – CoV-2 COVID-19.В настоящее время белок нуклеокапсид является одной из важных мишеней для изучения как гуморального, так и клеточного иммунного ответа на SARS – CoV-2. В этом исследовании последовательность гена SARS-CoV-2 «N», который кодирует соответствующий структурный белок, была преобразована в последовательность чисел с целью создания спеклов на основе гена. Различия в исходных нуклеотидных последовательностях были обнаружены и охарактеризованы с помощью виртуальных лазерных генных спеклов (GBspeckles). Показано, что при интерференции двух спекл-паттернов SARS – CoV-2 формируются два типа интерференционных картин: квазислучайная спекл-структура без интерференционных полос или полос, модулированная спеклами.Показано, что влияние интерференции двух GB-спеклов, генерируемых на нуклеотидных последовательностях вируса, можно рассматривать как новое направление в современной биоинформатике.

Показать аннотацию

В статье представлены результаты спектроскопического исследования «цветной» воды, обнаруженной в брызговых ваннах в надлитторальной зоне вулкана Алаид (Курильские острова) с 2015 по 2019 год.Купальни с пурпурной, красной и красно-желтой водой расположены в разных частях острова в разное летнее время. Анализ данных флуоресценции и поглощения проб воды выявил присутствие в воде большого количества бактериохлорофилла а, который является основным фотосинтетическим пигментом пурпурных серных бактерий. Предположение о наличии клеток микроорганизмов подтвердили наблюдения под микроскопом. Для определения морфотипа микроорганизмов из проб были приготовлены ацетонметанольные экстракты и исследованы спектральными методами.Характерные линии поглощения каротиноидов и мономерной формы бактериохлорофилла идентифицировали клетки как морфотипы Thiocystis и Thiorhodococcus пурпурных серных бактерий. Регулярное наблюдение за пробами воды с микроорганизмами в супралиторальной зоне вулкана Алаид позволяет сделать вывод, что развитие пурпурных фототрофных бактерий — не случайное событие, а типичное явление в этой местности. Тот факт, что каждый летний сезон окрашенная вода обнаруживалась в разных местах, свидетельствует о циклических изменениях условий жизни микроорганизмов от благоприятных местообитаний к неблагоприятным.

Показать аннотацию

Водные гуминовые вещества, или хромофорная фракция растворенного органического вещества (СDOM) в природной воде, обладают характерными оптическими свойствами.Значительные усилия были направлены на изучение оптических свойств РОВ и улучшение понимания биогеохимических циклов углерода в северных регионах. Однако из-за редких наблюдений на сегодняшний день имеется ограниченный объем данных об исследованиях CDOM в субарктических зонах. В данной работе обобщены спектрально-оптические свойства РОВД из нескольких мест вдоль двух берегов Белого моря. Спектры поглощения и флуоресценции излучения с разной длиной волны возбуждения были измерены для проб воды, отобранных в августе-сентябре 2020 года в экспедициях в несколько участков Карельского и Терского берегов, различающихся по геоморфологии, гидрологии и антропогенному влиянию.Было обнаружено, что флуоресценция зависит от возбуждения; мы наблюдали «голубой сдвиг» максимума излучения с увеличением длины волны возбуждения для всех исследованных образцов РОВД (поверхностные и глубоководные прибрежные воды). Спектры поглощения аналогичны по форме для всех исследованных образцов РОВ, однако значения поглощения отражают концентрацию гуминовых веществ в некоторых образцах. В заливе Лобаниха мы не обнаружили существенной разницы в глубинной и поверхностной РОВ, но в реликтовой лагуне в бухте Восточная Поря РОВ была сконцентрирована ближе к дну.Эти результаты важны для понимания механизмов формирования оптических свойств природной воды с РОВ разного происхождения.

Показать аннотацию

Экологический мониторинг естественных водоемов важен в Арктической зоне для изучения их эволюции под влиянием изменения климата и процессов урбанизации в регионе. В связи со специфическими условиями жизни аноксигенных фототрофных микроорганизмов их присутствие может указывать на сероводородное загрязнение водоема и служить маркером сероводорода.Это делает проблему оптической диагностики фототрофных бактерий очень актуальной и актуальной. Существует ряд спектральных методов определения хлорофилл-содержащих микроорганизмов. Однако спектральные свойства фотосинтетических бактериальных пигментов, бактериохлорофиллов (БХл), все еще плохо изучены. Мы впервые применили спектры флуоресценции экстрактов БХл для получения распределения БХл d по глубине в озере. Спектры испускания флуоресценции измеряли на люминесцентном спектрометре Solar CM2203 при возбуждении на длине волны 425 нм, соответствующей пику поглощения БХЛ d.В сентябре 2020 года максимальная концентрация БХл d была обнаружена на глубине 2,275 м (16700 мг / м ³ ) в озере Трехцветное. Толщина бактериальной пластинки не превышала 5 см, а распределение пигмента оказалось асимметричным по вертикали. Подчеркнем, что количественная оценка флуоресценции БХл d более чувствительна по сравнению со спектрофотометрическим, и позволяет оценить сверхнизкие концентрации БХл без предварительного концентрирования пробы воды.

Показать аннотацию

Показано, что обработка клубней картофеля регуляторами роста (препараты «Эпин-Экстра», «Циркон», «Силиплант») приводит к увеличению флуоресцентного параметра (F _M −F _T ) / F _T растений, выращенных из этих клубней, свидетельствует о повышении фотосинтетической активности растений.Обработка семенных клубней картофеля регуляторами роста, а также их смесями с фунгицидом «Максим КС» способствовала оптимизации ряда физиологических показателей: уменьшала убыль массы клубней при длительном хранении, степень их поражения болезнями. , а также потребление питательных веществ. Эта обработка привела также к увеличению последующей урожайности картофеля. Установлена ​​высокая положительная корреляция между флуоресцентным параметром (F _M −F _T ) / F _T листьев, с одной стороны, и урожайностью картофеля при различных вариантах его обработки перед хранением, — с одной стороны. Другой.

Показать аннотацию

НАДН — одна из центральных сигнальных молекул, которые служат субстратом для многих жизненно важных процессов, в частности, является донором цепи переноса электронов в митохондриях.При этом активность митохондрий и интенсивность обменных процессов в тканях разных отделов мозга резко различаются. Целью данной работы было сравнение скорости продукции НАД (Ф) Н в тканях различных отделов мозга (кора, мозжечок, гиппокамп, ствол мозга), оцениваемой по параметрам динамики его автофлуоресценции. Изучали острые срезы головного мозга крысы соответствующих участков. Для оценки активности митохондрий определяли интенсивность автофлуоресценции НАД (Ф) Н и скорость его продукции.После этого срезы были проанализированы гистологическим исследованием. Было замечено, что митохондриальная активность в тканях гиппокампа значительно выше, чем в других областях мозга, что может быть связано с более сложными когнитивными функциями гиппокампа у млекопитающих. Результаты этого исследования могут помочь объяснить избирательность поражения гиппокампа при ишемических повреждениях и нейродегенеративных заболеваниях.

Показать аннотацию

В статье представлены результаты оценки биоэнергетических параметров острых срезов головного мозга крысы путем измерения митохондриального пула и скорости продукции НАДН с помощью флуоресцентной визуализации.НАД + и НАДН играют решающую роль в энергетическом метаболизме митохондрий из-за их участия в цикле трикарбоновых кислот и в цепи переноса электронов. Поэтому важно знать вариабельность его содержания в клетках. В исследовании мы использовали подход, основанный на регистрации аутофлуоресценции НАДН. Экспериментальная установка была разработана и собрана для визуализации острых срезов головного мозга, но также способна измерять культуры клеток головного мозга. Для возбуждения флуоресценции на длине волны 375 нм использовали лазер BDL-SMN-375 (Becker & Hickl, Германия).Оценивали параметры содержания НАДН как в острых срезах головного мозга, так и в культурах клеток среднего и коркового мозга. Полученные результаты могут быть интересны для лучшего понимания развития нейродегенеративных заболеваний митохондриальной дисфункции.

Показать аннотацию

Оптическая очистка кожи — это метод, обеспечивающий увеличение глубины и контрастности неинвазивных оптических методов.Обезвоживание — один из возможных механизмов оптического просветления, который может привести к уменьшению как толщины кожи, так и обратного рассеяния. Однако вклад дегидратации кожи в коллимированные спектры пропускания детально не изучен. В данной статье представлены результаты такого исследования на коже крысы ex vivo. Обезвоживание образца кожи осуществляли с помощью вентилятора с нагревателем. На протяжении всего эксперимента поток теплого воздуха (~ 36 ° C) направлялся на кожную сторону каждого образца. Спектры пропускания были получены с помощью системы из двух световодов, оснащенных коллиматорами в диапазоне длин волн 400-800 нм.Толщину измеряли во время обезвоживания с помощью микрометра. В результате было обнаружено, что уменьшение толщины образца кожи при обезвоживании приводит к увеличению пропускания света через кожу (11-кратное увеличение при λ = 700 нм) и, в то же время, к увеличению пропускания света через кожу. увеличение коэффициента ослабления света μt за счет увеличения концентрации рассеивателей в коже в единице объема.

Показать аннотацию

Представлен метод цветного картирования потока для офтальмологических применений оптической когерентной томографии (ОКТ). Описанный алгоритм разработан с учетом специфических изменений интерференционного сигнала, вызванных характеристиками потока биологической жидкости через плоскость сканирования.Ключевой особенностью алгоритма является многоступенчатый анализ флуктуаций спекл-структуры ОКТ-изображений. Спекл-паттерн идентифицируется с помощью функции реверса цвета, свертки, ограничения порога, морфологической цифровой обработки, создания выпуклой оболочки, обработки на основе градиента и перекодирования изображений. Пики интенсивности интерференционного сигнала, вызванные резким изменением оптических свойств на границах сильно рассеивающих слоев (сетчатка имеет многослойную структуру), сглаживаются для картирования спекл-структур.Коэффициенты корреляции одних и тех же частей последовательности структурных ОКТ-изображений рассчитываются не для интенсивностей пикселей, а для ранее идентифицированного спекл-паттерна. Значения дисперсии между неперекрывающимися частями одного и того же структурного изображения вычисляются также не для интенсивности пикселей, а для ранее идентифицированного спекл-паттерна. Количественная оценка абсолютной скорости потока производится стандартным способом, т.е. с учетом временных интервалов между моментами сбора соответствующих частей интерференционного сигнала.

Показать аннотацию

Описан метод исследования атеросклеротических бляшек на стенках крупных кровеносных сосудов.Метод основан на исследовании первичных данных внутрисосудистой оптической когерентной томографии (IOCT). Выявление составляющих жира, кальция, кристаллов холестерина, скоплений макрофагов, сгустков крови и т. Д. В зонах атеросклеротического поражения сосудов основано на исследовании только двух параметров. Интенсивность интерференционного сигнала A-сканирования является первым параметром, а биомеханические свойства (в первую очередь модуль Юнга) — вторым анализируемым параметром. Пульсовая волна используется как наименее травматичное деформирующее воздействие.Величина деформирующего воздействия на кровеносные сосуды рассчитывается путем усреднения разницы артериального давления. Эти данные получают с помощью инвазивного датчика давления. Структурные IOCT-изображения, соответствующие моментам систолы и диастолы, выбираются из последовательности исходных данных. Оба изображения IOCT сегментированы и классифицируются по интенсивности сигнала. В первую очередь, идентификация сегментов основана на справочных данных об оптических свойствах компонентов атеросклеротических бляшек. Сегменты с одинаковым геометрическим расположением и интенсивностью сигнала сгруппированы в пары.Центроиды рассчитываются для всех сегментов. Абсолютные смещения сегментов оцениваются смещением центроидов. Площадь деформации считается равной площади сканирования наложенного внутрисосудистого зонда. Размеры деформируемой области для набора сегментов двух анализируемых изображений вычисляются относительно осей координат и затем усредняются. Биомеханические свойства сегментов рассчитываются по классическим формулам и используются для обновления значений первичной идентификации структурных компонентов атеросклеротических бляшек.Информация о геометрических характеристиках и внутренней структуре атеросклеротических бляшек используется для определения их свойств и текущей стабильности.

Показать аннотацию

Описаны способ изготовления тканеподобных фантомов сосудов головного мозга и устройство для реализации в них пульсирующих потоков.Кровеносные сосуды вылеплены вместе с моделями несущих их органов. Фантом кровеносного сосуда представляет собой полую структуру с трехслойными стенками, имитирующими ее геометрию, структуру, неоднородность оптических и механических свойств. Модель органа служит только для фиксации его полой структуры в анатомически правильном положении и поэтому однородна по фактуре и свойствам. Источником информации о геометрии имитируемого кровеносного сосуда являются результаты ангиографии реального клинического случая.Трехслойная структура фантомов оправдана анатомическими особенностями реальных кровеносных сосудов (внешний слой — адвентиция, средний слой — медиа, внутренний слой — интима). Трехслойная структура изготовлена ​​путем послойного нанесения прозрачного двухкомпонентного жидкого силикона на восковую основу. Каждый слой отличается своей толщиной и уникальной концентрацией специальных добавок (наночастиц диоксида титана и впитывающего красителя). Механические свойства слоев изменяются за счет изменения концентрации компонентов прозрачного жидкого силикона.Фантом затвердевает, а затем нагревается, чтобы удалить воск. Затем фантом кровеносного сосуда помещается в слепок соответствующего органа. Имитирующий орган также изготовлен из двухкомпонентного прозрачного жидкого силикона со специальными добавками. И проксимальный, и дистальный концы полой конструкции соединены вилочными катетерами. 1% раствор интралипида в воде используется для моделирования кровотока в фантоме. Регулирование скорости потока жидкости, имитирующей кровь, обеспечивается шприцевым насосом.Пульсирующий поток создается контролируемым перекручиванием трубки между насосом и фантомом кровеносного сосуда. Вибрационный двигатель используется для изменения профиля скорости. Описанная экспериментальная модель гидродинамического фантома кровеносного сосуда используется в сочетании с внутрисосудистой оптической когерентной томографией для проверки свойств компрессионной эластографии.

Показать аннотацию

Показатель однородности дозирования таблеток «Папазол» двух производителей оценивали по XIV Государственной фармакопее России и по методике Principal Component Analyis (РСА).Фармакопейный метод показал, что таблетки «Папазол» («Фармстандарт-Лексредства») удовлетворяют требованиям по однородности дозирования. Таблетки «Папазол» («Ирбитский химико-фармацевтический завод») не соответствуют требованиям по однородности дозирования. Исследована возможность применения метода PCA для экспресс-тестирования таблеток «Папазол» на однородность дозирования. Полученные результаты согласуются с данными, полученными с использованием метода прямого фармакопейного определения. Цель этого исследования состояла в том, чтобы представить метод спектрофотометрии в сочетании с подходами к хемометрии как простой, экономичный и точный для тестирования индикатора однородности дозирования в фармацевтическом составе.

Показать аннотацию

В данной работе рассматривается возможность использования машинного обучения в спектральном анализе выдыхаемого воздуха для ранней диагностики заболеваний. Экспериментальная установка состоит из квантового каскадного лазера с диапазоном перестройки 5,4–12,8 мкм и астигматической газовой ячейки Эррио. Для идентификации биомаркеров и их смесей используется неглубокая сверточная нейтральная сеть и анализ главных компонентов.Минимальная обнаруживаемая концентрация ацетона и этанола на уровне ниже ppm достигается для длины оптического пути до 6 м и отношения сигнал / шум менее 3. Показано, что нейронные сети по сравнению со статистическими методами дают более низкие пределы обнаружения для такое же отношение сигнал / шум в измеряемом спектре.

Показать аннотацию

Терагерцовые (ТГц) технологии демонстрируют значительный потенциал для медицинских и биологических приложений. Несмотря на небольшую глубину проникновения ТГц волн в биологические ткани из-за поглощения интерстициальной водой, замораживание тканей может использоваться для преодоления этого ограничения до определенного предела.Кроме того, применение низких температур приводит к изменению диэлектрических свойств тканей, что открывает дополнительные возможности терагерцовой спектроскопии для изучения различных состояний и состояний тканей, в частности, для наблюдения за их замерзанием при криоабляции. В этой работе экспериментально продемонстрирована контрастность показателей преломления незамороженных и замороженных образцов жировой ткани и ткани печени ex vivo, а также возможность определения глубины замерзания с помощью импульсной ТГц спектроскопии.

Показать аннотацию

Люголь как антисептический краситель на основе йода и глицерина широко используется в клинической стоматологии для выявления участков деминерализации зубов и выявления начального кариеса.В данной работе определены кинетические параметры диффузии Люголя (водный раствор йодида калия (0,02 мас. / Мас.) И глицерина (0,94 мас. / Мас.)) В дентине человеческого зуба. Модифицированный второй закон Фика, модель свободной диффузии и спектроскопия диффузного отражения были использованы для определения эффективного коэффициента диффузии Люголя (бинарные коэффициенты диффузии тканевой воды и комплекса йода / глицерина) в дентине человеческого зуба. Количественные параметры проникновения Люголя в дентин человеческого зуба и изменение его оптических свойств следует учитывать при составлении клинических протоколов лечения стоматологических заболеваний с помощью фототерапии, физиотерапии, фотодинамической терапии, лазерного лечения и др.

Показать аннотацию

Медицинские методы визуализации мозга, диагностики и лечения на основе источников света являются очень распространенными клиническими инструментами.Однако применение этих методов ограничено из-за сильного ослабления света в коже черепа и черепа. Такое оптическое затухание снижает достижимое пространственное разрешение и препятствует визуализации мелких деталей, таких как микрососуды мозга. Настоящее исследование направлено на разъяснение существующих методов обеспечения желаемого оптического доступа к мозгу с хорошей визуализацией микрососудов. Стратегия включает использование прозрачных черепных имплантатов и оптических очищающих агентов для улучшения оптического доступа для лазерной спекл-визуализации микрососудов головного мозга.Эксперименты по лазерной спекл-визуализации in vivo на мышах и кровеносных сосудах головного мозга показали, что предлагаемый оптический доступ с комбинированным коэффициентом пропускания оптически очищенной кожи головы, покрывающей прозрачный черепной имплантат, увеличивает отношение сигнал / шум и разрешение изображения, что позволяет визуализировать микрососуды через прозрачный имплантат. , что было невозможно из-за неочищенного скальпа и неповрежденного черепа.

Показать аннотацию

Стрессовые состояния организма сопровождаются гормональной реакцией, в том числе повышением уровня гормона кортизола. В связи с тем, что кортизол содержится во многих биологических жидкостях человеческого тела, а также накапливается в некоторых тканях, исследователей привлекает возможность определения кортизола с помощью методов оказания медицинской помощи, которые включают иммунохроматографический анализ.В этой статье обсуждаются некоторые важные практические нюансы, которые необходимо учитывать при создании тест-полоски для определения кортизола, например, в слюнной жидкости человека. Ключевые слова: кортизол, наночастицы золота, стресс, слюна, иммуноферментный анализ бокового потока, тест-полоски. 1. ВВЕДЕНИЕ

Показать аннотацию

Целью исследования было оценить эффективность оригинального лечения пациентов с псориазом, включая VLOK-525 и локальное воздействие импульсного IR NEELIE.Под наблюдением 264 пациентов с распространенными формами псориаза в прогрессирующей стадии (163 мужчины и 101 женщина) в возрасте от 24 до 63 лет (средний возраст — 41 год), которым диагностировали заболевание от 1 до 30 лет назад. . В основную группу комплексного лечения вошли оригинальные лазерные методики аппарата «ЛАЗМИК ВЛОК» с лазерным излучателем КЛ-ВЛОК-525-20 для внутривенного лазерного облучения крови и МЛ-635-40 для внешнего воздействия. Показано, что комбинированная лазерная терапия больных средней формой псориаза (10 Оптические свойства модельных тканей холангиокарциномы в спектральном диапазоне 350-2250 нм при лечении лазерным фототермолизом
Авторы): Вадим Д. Генин; Алла Борисовна Бучарская; Элина А. Генина; Георгий Сергеевич Терентюк; Николай Г. Хлебцов; Валерий В.Тучин; Алексей Николаевич Башкатов

Показать аннотацию

В статье представлено исследование изменения оптических свойств холангиокарциномы, легированной золотыми наностержнями, трансплантированной крысе после лазерно-индуцированной плазмонно-резонансной фототермической обработки (ФФТ). За 72, 48 и 24 часа до эксперимента животным внутривенно вводили суспензию золотых наностержней.Для облучения использовался диодный лазер с длиной волны 808 нм. После облучения опухоли и окружающие ткани были удалены и нарезаны. Изучаемые образцы: кожа, подкожная соединительная ткань, капсула опухоли, верхняя, центральная и нижняя части опухоли. Спектры полного пропускания и диффузного отражения образцов измеряли в диапазоне длин волн 350-2250 нм. Коэффициенты поглощения и приведенного рассеяния опухолевыми тканями рассчитывались методом обратного сложения-удвоения.Результаты эксперимента сравнивались с результатами исследования контрольных тканей без введения золотых наностержней и ПФТ. Было получено снижение коэффициента поглощения опухолевыми слоями в полосах поглощения воды, что свидетельствовало об обезвоживании тканей во время ФРТ. Уменьшение приведенного коэффициента рассеяния опухолевых слоев свидетельствовало об увеличении размеров рассеивателей и увеличении их упорядоченности. Изменения оптических параметров кожи и подкожного слоя были незначительными, что свидетельствовало о слабом термическом повреждении.

Показать аннотацию

Обсуждается возможность эндовенозной лазерной коагуляции с использованием Ti-содержащих оптотермальных волоконных конвертеров (ТОТВК).Оптические и тепловые модели были разработаны для оценки распределения излучения и температуры в вене во время эндовенозной лазерной коагуляции при использовании TOTFC для длин волн 532 нм, 810 нм, 980 нм, 1064 нм, 1310 нм, 1470 нм, 1910 нм и 2100 нм. . Были получены и оценены распределения интенсивности излучения вокруг TOTFC и на стенке сосуда. Рассчитана эффективность поглощения лазерной энергии с разными длинами волн для ТОТВК. В результате теплового расчета для разных длин волн была определена средняя мощность лазера от 8 до 15 Вт при скорости тракции от 1 до 7 мм / с, термодинамика стенки кровеносного сосуда и TOTFC.Во время эндовенозной лазерной коагуляции температура внутри ТОТФК превышает 500 ° C. Определены оптимальные сочетания средней мощности лазера и скорости тракции титансодержащего преобразователя для коагуляции стенки вены.

Показать аннотацию

Теги рамановского рассеяния с усиленной поверхностью демонстрируют многообещающий потенциал для приложений биовизуализации in vitro и in vivo из-за отсутствия фотообесцвечивания и узких спектральных линий.Однако воспроизводимый и контролируемый рост наноструктур с высокой плотностью горячих точек все еще остается проблемой. В этой работе мы сообщаем об улучшенной стратегии синтеза рамановских тегов ядро ​​/ оболочка с высокой плотностью горячих точек из лепестковых структур оболочки и высокой скоростью иммобилизации репортерных молекул. Стратегия основана на одновременном росте и функционализации репортера оболочки Au вокруг наносфер Au, покрытых 4-нитробензолтиолом. Мы получили, что количество добавленного 4-нитробензолтиола контролирует структуру полученных частиц.Были получены различные типы частиц, включая рамановские метки с зазором (GERT) с твердой оболочкой, лепестковые GERT, пористые частицы Au, заполненные рамановскими молекулами. Оптимизированные лепестковые метки (p-GERT) демонстрируют отклик SERS в 50 раз выше, чем обычные рамановские метки с усилением промежутков, что делает их пригодными для спектроскопии на уровне отдельных частиц. Благодаря высокому отклику SERS и уникальной пористой структуре эти наночастицы имеют большой потенциал для биомагирования и других приложений.

Показать аннотацию

Нанотехнологии активно используются для диагностики, лечения и профилактики коронавирусов. На сегодняшний день разработаны методы получения антител и прототипы вакцин против четырех типов коронавирусов.Это: коронавирус трансмиссивного гастроэнтерита, птичий коронавирус, коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома и коронавирус SARSCoV-2. Наночастицы золота можно использовать в качестве адъювантов для повышения эффективности вакцин за счет стимуляции антигенпрезентирующих клеток и обеспечения контролируемого высвобождения антигена. Таким образом, наночастицы золота, обладающие адъювантными свойствами, могут быть отличным инструментом при разработке эффективных вакцин против инфекционных заболеваний.

Показать аннотацию

В настоящее время GERT-метки широко используются в качестве наночастиц в различных областях биочувствительности и биоимиджинга. Это связано с их высоким откликом SERS и напрямую зависит от их структуры. Понимание зависимости рамановского сигнала от структуры GERT является ключом к созданию пользовательских тегов с требуемым откликом SESR.В связи с этим мы получили GERT-метки на основе различных наноядер и провели сравнительный анализ их свойств SERS. Использовались три типа сердцевины: наносферы, нанополигоны и наностержни. В качестве репортера комбинационного рассеяния использовали бензоледитиол-1,4. Интенсивность сигнала увеличивалась в серии сфер-многоугольников-стержней, а максимум коэффициента усиления SERS был получен от GERT на основе наностержней порядка 2E + 06.

Показать аннотацию

В данной работе мы представляем возможность использования сенсора на основе люминесцентных углеродных наноструктур (CNS), который является хорошей альтернативой многоступенчатым методам определения ионов тяжелых металлов и канцерогенных веществ. Подход основан на принципах «зеленой химии»: эффективно, просто, быстро.В рамках работы было изучено влияние различных условий синтеза на чувствительность ЦНС к присутствию различных ионов. Было обнаружено, что сенсоры на основе различных полисахаридов чувствительны к присутствию в растворе дихромат-ионов.

Показать аннотацию

В последнее время наблюдается большой интерес к потенциальному использованию наночастиц металлов в различных областях: физике, медицине, микроэлектронике, биологии и др. Наночастицы меди не уступают по свойствам наночастицам благородных металлов, однако они намного дешевле и доступнее. .В данной работе показано получение эффективного бактерицидного композита с наночастицами меди. В качестве матрицы для создания композита использовался глауконит Белоозерского месторождения Саратовской области. Глауконит может быть стабилизатором для нестабильных на воздухе наночастиц меди. Структура глауконита имеет наноразмерную пористость, что в значительной степени увеличивает эффективную поверхность сорбции. Наночастицы меди, полученные химическим восстановлением, были иммобилизованы на глауконитовой матрице. Сорбцию наночастиц контролировали спектрофотометрически.Бактерицидная эффективность полученного нанокомпозита исследована в отношении клинических штаммов бактерий. Эти исследования могут быть востребованы в ветеринарии, сельском хозяйстве и медицине после дополнительных исследований.

Показать аннотацию

Мы исследуем возможность повторного использования растворов ЦТАБ для повторного синтеза золотых наностержней. Решены три задачи. Первая задача — очистить ростовые растворы от золотых наностержней. Вторая задача — разработать метод с использованием очищенного раствора бромида цетилтриметиламмония для повторного синтеза золотых наностержней с теми же оптическими свойствами, что и в исходном синтезе.Третья задача — проверить возможность управления оптическими свойствами наностержней для повторного синтеза. Полидисперсность наностержней оценивается по форм-фактору с помощью математической модели.

Показать аннотацию

Легированные квантовые точки (КТ) — люминесцентные полупроводниковые нанокристаллы, перспективные материалы в различных областях науки и техники, в том числе в биоанализе. Ключевым требованием к легированным квантовым точкам при анализе полярных растворов является гидрофильность.Модификация дигидролипоевой кислотой (DHLA) позволяет повысить коллоидную стабильность легированных КТ в полярной среде при сохранении преимуществ наночастиц такой структуры, а также позволяет в дальнейшем электростатическую самосборку легированных КТ с антителами. В статье описана DHLA-модификация состава легированных КТ Cd _x Zn _1-x Se _y S _1-y / ZnS с использованием 2-меркаптоэтанола (BME) в качестве дополнительного гидрофилизирующего агента.Было изучено влияние условий гидрофилизации на следующие модифицированные свойства легированных КТ: квантовый выход фотолюминесценции (PLQY), ширина пика на полувысоте (FWHM), положение пика люминесценции, коллоидная стабильность при длительном хранении. Осуществлен поиск оптимального соотношения гидрофилизирующих агентов DHLA: BME, при котором преимущества билигандной оболочки будут максимально реализованы. Представленные в работе методы позволяют получать легированные КТ с высоким PLQY (около 65%) и длительным периодом стабильности (более 3 месяцев).

Показать аннотацию

Мы демонстрируем люминесцентные углеродные наноструктуры (LCN) с желто-оранжевой эмиссией, синтезированные из лимонной кислоты (CA) и мочевины путем гидротермальной обработки.LCN обрабатывали в воде и N, N-диметилформамиде (ДМФ) при 160 ° в течение 6 часов. В этом случае увеличение полярности растворителя приводит к смещению люминесценции LCN в более длинную эмиссионную область. Смесь LCN, обработанную в DMF, фракционировали с помощью эксклюзионной хроматографии. Было получено 33 фракции с тремя типами эмиссионных сайтов при 460 нм (фракции 1-7 и 11-33), 540 нм (фракции 8-13) и 620 нм (фракции 12-33).

Показать аннотацию

В этом теоретическом исследовании используются магнитные наночастицы, такие как суперпарамагнитные наночастицы оксида железа (Fe ₃ O ₄ ). Эти частицы представляют собой уникальную наноплатформу с большим потенциалом для разработки систем доставки лекарств через кровеносные сосуды благодаря их биосовместимости и стабильности.Численно исследованы механизмы движения магнитных наночастиц в ньютоновской жидкости (крови) в постоянном магнитном поле. Уравнения движения частиц в потоке управляются комбинацией магнитных уравнений для поля постоянного магнита и уравнений Навье-Стокса для жидкости. Эти уравнения были решены численно с помощью программного обеспечения COMSOL Multiphysics Modeling Software.

Показать аннотацию

Зарождение в пластифицированных полимерах как первая стадия синтеза высокопористых полимерных матриц под действием температуры или давления является ключевым фактором, влияющим на структурные свойства синтезированных матриц. Соответственно, количественная оценка процессов роста / коллапса в ансамблях поровых зародышей во время их эволюции имеет важное значение для характеристики и контроля морфологических и функциональных свойств матриц.Кроме того, анализ кинетики роста / разрушения зародышей одной поры позволяет оценить физико-химические свойства (поверхностное натяжение, массовая доля пластификатора в полимере) в зависимости от внешних условий. В этой работе обсуждаются робастные процедуры анализа изображений для количественного описания эволюции пор на основе данных видеорефлектометрии. Приведены экспериментальные результаты, полученные при сверхкритическом / субкритическом вспенивании полилактидов.

Показать аннотацию

В настоящее время существуют различные методы, позволяющие улучшить физико-механические свойства металлообрабатывающего инструмента.Газовое азотирование — один из этих методов. В данной работе предлагается улучшение физико-механических свойств изделий из быстрорежущей инструментальной стали с помощью индукционной химико-термической обработки (ИХОТ) в азотсодержащей среде. В результате применения кратковременной обработки методом ICTT твердость поверхностного слоя изделий достигает не менее 17–20 ГПа при толщине слоя в пределах 0,8 мм. Предлагаемый способ позволяет улучшить функциональные качества металлообрабатывающих изделий, работающих в условиях трения с повышенными контактными нагрузками.

Показать аннотацию

Структурно-морфологические характеристики плазменно-напыляемых покрытий на титановой основе с использованием порошков цинк-, магнийсодержащих фосфатов кальция исследованы методами оптической и растровой электронной микроскопии.Покрытия состоят из нанесенных частиц размером 50 — 150 мкм. Частицы образуют агломераты размером 200 мкм и более. Использование таких режимов плазменного напыления порошков металлсодержащих фосфатов кальция: ток плазменной дуги — 300-350 А, расстояние напыления — 50-100 мм, диспергирование порошка — до 90 мкм, расход транспортного газа — 5-7 л / г. мин, возможно формирование равномерного покрытия.

Показать аннотацию

Комбинированные материалы, имеющие высокопрочную и износостойкую рабочую поверхность, используются в обрабатывающей промышленности. Для получения материалов, обеспечивающих высокие показатели износостойкости, требуется сложное технологическое оборудование. Также возможно использование материалов, имеющих твердую основу с защитным покрытием из износостойкого высокотвердого материала.Поэтому был разработан метод контактной сварки для нанесения покрытия из технически чистого титана на поверхность высокоскоростной инструментальной стали 1.3343 (аналог R6M5) с последующей модификацией поверхности титана и всей сборки путем высокотемпературного индукционного нагрева для получения износостойкости. В данной работе рассматривается стойкое оксидное покрытие.

Показать аннотацию

Параметры, определяющие манипуляции с наночастицами, зависят от параметров освещающего оптического поля. Это приводит к ряду фундаментальных ограничений. Например, мощность ограничена длиной падающей волны. Однако есть несколько способов обойти эти ограничения. В этой статье мы демонстрируем, что оптическая мощность действует на наночастицу, расположенную рядом с отверстием, сделанным в теневой поверхности диэлектрической частицы с размерами длины волны и контрастом показателя преломления 1.8, как оптический магнит, и наночастица перемещается в наноотверстие. Численное моделирование показывает, что свет может быть захвачен внутри наноотверстия, даже если размер отверстия составляет всего λ / 100, и поэтому оптический магнит может притягивать наночастицы, по крайней мере, такого же размера. Использование такого оптического магнита представляет интерес в первую очередь для очистки поверхностей и в биомедицинских целях.

Показать аннотацию

В данной работе представлены результаты моделирования процесса химико-термической обработки (ХХО) титановых дискообразных образцов, находящихся в контейнере с углеродсодержащей средой. Основными параметрами рассматриваемого процесса были ток индуктора и геометрия системы «индуктор — контейнер — образец», а именно количество витков, высота и внутренний диаметр индуктора при постоянных значениях высоты и внешнего диаметра индуктора. контейнер для СНТ.Рабочая температура внешней поверхности контейнера изменялась в диапазоне от 1100 ° C до 1350 ° C, что достигалось при токе индуктора от 3,4 кА до 5,0 кА в узком диапазоне частот 88 ± 2 кГц. Полученные графики распределения температурных полей позволили оценить эффективность нагрева индукторов различной конструкции.

Показать аннотацию

Рассмотрен метод адаптивной винеровской фильтрации с приложением к динамической оценке параметров низкокогерентных интерференционных полос.Продемонстрирована возможность определения огибающей низкокогерентного интерферометрического сигнала, а также оценки локального фазового шага дискретного сигнала через оцененные коэффициенты адаптивного фильтра Винера, полученные по критерию минимизации среднеквадратичной ошибки относительно заданного опорного сигнала. Представлены экспериментальные результаты низкокогерентной обработки интерферометрических сигналов для приложений к бесконтактной профилометрии поверхности и для оценки внутренней микроструктуры полупрозрачных объектов.

Показать аннотацию

Анализ влияния электромагнитного поля низкой интенсивности на процессы самосборки ядер гистонов h4.2 и h5. Для изучения самоорганизации гистонов h4.2 и h5 использовали метод клиновидной дегидратации. Имидж-фациальный анализ включал их качественные характеристики, а также расчет количественных показателей с последующим статистическим анализом. Установлено, что УВЧ-излучение (1 ГГц, 0,1 мкВт / см ² , 10 мин) существенно изменяет процесс самосборки ядер гистонов h4.2 и h5. Установленный факт влияния электромагнитного поля низкой интенсивности на процесс самосборки ядер гистонов открывает перспективу дальнейшего изучения биологических эффектов этого типа излучения.

Показать аннотацию

Микроструктурированные оптические волокна (MOF) являются высокоэффективной опорой для проектирования и изготовления чувствительных и недорогих датчиков.В настоящее время молекулярный импринтинг является одним из перспективных методов функционализации внутренней поверхности MOF. Молекулярно импринтированные полимеры (MIP) могут быть синтезированы на внутренней поверхности MOF и увеличивать селективность и эффективность сорбции целевых молекул. Такой подход может быть основой для селективной сорбции и обнаружения целевых молекул на одном сенсорном устройстве. В этой статье описывается модификация MOF с помощью MIP, селективного в отношении бычьего сывороточного альбумина (BSA). Полианилин использовали в качестве матричного MIP-полимера и получали химической окислительной полимеризацией анилина в мягких кислотных условиях.Спектр пропускания MOF использовался для мониторинга связывания между молекулами белка и MIP.

Лизоцим и билирубин связываются с АПФ и регулируют его конформацию и выделение.

Новая мутация АПФ, связанная с повышенной активностью АПФ в крови. повышение активности АПФ (в 7 раз по сравнению с контролем) (рис.1А). Мы исследовали потенциальные мутации в области стебля ACE, вызывающие усиление его выделения.

Активность и конформация АПФ в образцах плазмы.

( A ) Активность АПФ в 84 образцах гепаринизированной плазмы от пациентов с различными легочными заболеваниями (Hip-His-Leu в качестве субстрата АПФ).Данные были выражены как% индивидуальной активности АПФ от среднего значения (зеленый) для здоровой контрольной группы. Синие столбцы — образцы с активностью АПФ выше среднего + 2SD. Красная полоса — образец (№38) с предполагаемой мутацией ACE. ( B ) Активность АПФ, осажденная mAb 1B3 и 1B8 из плазмы пациента № 38 и из плазмы субъектов с различными мутациями АПФ, идентифицированными ранее (W1197X ¹¹ , P1199L ¹⁰ , Y465D ¹³ и IVS25 + 1G > A ¹² ), было нормализовано к осажденному mAb 9B9 ¹⁹ .Нижняя строка в легенде до B — страна происхождения каждой мутации. Желтые полосы — образцы с соотношением mAb / 9B9 ниже 80% от контроля. Красные столбцы — образцы с соотношением mAb / 9B9 выше 20% от контроля * p <0,05 по сравнению со средним значением для контрольной группы.

Затем мы секвенировали все экзоны ACE и идентифицировали замену R532W в N-домене зрелого белка ACE (рис. S1B). Этот остаток удален от области стебля и расположен на другой стороне глобулы N домена от предполагаемого интерфейса димера N домена ¹³ .Субъект №38 является гетерозиготным по мутации R532W (рис. S1B), который указан в GenBank как rs4314 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/) и обнаружен в 5 из 6220 протестированных хромосом.

Вестерн-блот-анализ клеток СНО, экспрессирующих АПФ дикого типа (WT) или мутантных R532W, показал, что эта мутация не смогла изменить экспрессию АПФ или повлиять на димеризацию АПФ. Мы пришли к выводу, что высокая активность АПФ в плазме у субъекта № 38, носителя мутации ACE R532W, вероятно, является результатом изменений в выделении АПФ, возможно, через конформационные изменения.Эта возможность была подтверждена конформационным фингерпринтингом мутантного АСЕ R532W, который выявил множественные конформационные изменения в доменах N и C и резкое снижение связывания мАт 6A12 (рис. S2), которое взаимодействует с остатком 532 домена N.

АПФ-связывающие компоненты крови регулируют выделение АПФ

Каков механизм этой новой мутации в N-домене АПФ, очень далеко от области стебля, где мембраносвязанный АПФ расщепляется еще не идентифицированной секретазой АПФ? Как эта мутация могла изменить скорость выделения АПФ мутанта R532W? Ранее мы продемонстрировали, что связывание двух mAb с разными, но перекрывающимися эпитопами на N-домене ACE, 9B9 и 3A5, вдали от границы раздела димера N-домена, включая остаток Y465, приводит к увеличению в 2–4 раза. в соматическом шеддинге АПФ ²¹ .Следовательно, конформационные изменения в N-домене АПФ, индуцированные связыванием некоторых mAb, могут приводить к конформационным изменениям в стеблевой области соматического АПФ и, таким образом, усиливать шеддинг соматического, двухдоменного ACE ^21,22 .

Разбавление плазмы / сыворотки человека (а также добавление ингибитора АПФ) привело к увеличению относительного связывания нескольких mAb с эпитопами как на N-, так и на C-доменах АПФ (рис. 2A – C), тогда как связывание этих mAb к рекомбинантному АПФ или очищенному АПФ из семенной жидкости не изменяли при разбавлении (не показано).Мы предположили, что соединение (я) в крови может связываться с АПФ, а затем диссоциировать во время разведения. Они не могли быть эндогенными ингибиторами АПФ, поскольку наиболее значительное увеличение связывания при разведении (которое вызывает диссоциацию ингибиторов АПФ) было продемонстрировано для mAb 1G12 и 6A12 (рис. 2), тогда как связывание обычных ингибиторов АПФ с АПФ в плазме только напротив, резко увеличивалось связывание этих mAb (фиг. 2D). Следовательно, связывание mAb 1G12 и 6A12 должно уменьшаться при разведении и диссоциации ингибитора из комплекса с АПФ.Влияние субстратов АПФ на связывание mAb 1G12 / 6A12 с АПФ крови было более скромным: AI и BK (+ 100%) и субстанция P (+ 50%) (p <0,05, не показано), в то время как эффект эналаприлата был довольно значительным. - + 300% (рис. 2D).

Влияние разведения плазмы на связывание mAb с АПФ крови.

( A — C ) Осаждение активности АПФ из образцов плазмы проводили с 16 мАт к различным эпитопам человеческого АПФ, как показано на фиг. 1В, с использованием объединенной сыворотки крови человека (от 10 здоровых людей) в различных разведениях, 1 / 2.5, 1/5, 1/10 и 1/20. ( A , B ) Данные выражены в виде процента отношения преципитации активности ACE выбранным mAb при данном разведении к таковому при разведении 1 / 2,5 (100%). ( C ) Влияние 8-кратной разницы в разведении на преципитацию ACE всеми 16 mAb (разведение 1 / 2,5 — 100%). ( D ) Влияние ингибитора АПФ эналаприлата (100 нМ) на преципитацию АПФ с помощью этого набора mAb. Данные представляют собой среднее значение + стандартное отклонение трех повторов. Полосы, выделенные оранжевым и красным — значения активности осажденного АПФ от мутантного АПФ были более чем на 20% и 100% соответственно выше, чем эти значения для WT.Желтые полосы — образцы с соотношением mAb / 9B9 ниже 80% от контроля. Цветные полосы показывают, что различия в соотношениях статистически значимо различаются (p <0,05).

Положения эпитопов, чье связывание mAb с АПФ увеличивалось при разбавлении плазмы человека, также дало некоторую дополнительную информацию. Сильно перекрывающиеся эпитопы mAb 1G12 и 6A12 в N-домене расположены рядом с эпитопом mAb 1E10 в соседнем C-домене (фиг. 3). Следовательно, возможно, что неизвестные соединения из крови могут связываться с участками, покрывающими АПФ, на обоих доменах АПФ (рис.3), а затем диссоциируют при разбавлении.

Предполагаемый комплекс АПФ с АПФ-связывающим белком из крови.

Модель соматического ACE человека была сконструирована с использованием модели соматического ACE свиньи на основе электронной микроскопии (EM) ⁵⁹ . В частности, модель EM была наложена на домен N человеческого ACE (PDB 3NXQ). Затем домен C человека (PDB 1086) был наложен на домен C модели EM. Эпитопы были помечены на доменах N и C, как описано ранее ^{22,44,51,60,61,62,63} .Картирование эпитопов в доменах N и C визуализировали в Chimera и PYMOL. Положение замены R532W показано стрелкой. Предполагаемый АПФ-связывающий белок был прикреплен к щели между N- и С-доменами модели двухдоменного человеческого АПФ таким образом, чтобы замаскировать эпитопы для mAb 1G12 / 6A12 в N-домене и эпитоп для mAb 1E10 в C-домене. .

Выделение АПФ из клеток CHO-ACE ингибировалось в 2–3 раза в присутствии сыворотки крови человека и крупного рогатого скота (рис. S3). Выделение АПФ R532W было сравнимо с выделением АПФ дикого типа в бессывороточную среду, тогда как в присутствии 10% сыворотки человека скорость выделения мутантного АПФ составляла ~ 2.В 5 раз выше, чем АПФ дикого типа (рис. S3A), то есть уменьшение выделения АПФ, вызванное присутствием сыворотки, было менее выраженным для мутантного АПФ. Мы предположили, что соединения плазмы / сыворотки, такие как АПФ-связывающий белок (белки) и / или компоненты LMW, стабилизируют конформацию АПФ на поверхности клетки, таким образом предотвращая чрезмерное выделение, в то время как мутант АПФ R532W демонстрирует сниженную способность связывать эти соединения из сыворотки и , следовательно, теряется более эффективно.

Влияние сыворотки на процесс расщепления / секреции белков эндотелиальных клеток подробно изучалось в прошлом.Общее количество белков, отщепленных от их поверхности, особенно белков с более высокой молекулярной массой, резко увеличивалось в присутствии сыворотки, вероятно, из-за защиты недавно высвобожденных белков от деградации ²³ . Было также показано, что сыворотка стимулирует расщепление некоторых мембранных белков, то есть предшественника TNF-α ²⁴ . Снижение выделения АПФ в присутствии сыворотки указывает на специфичность этого эффекта, что может быть напрямую связано с высоким уровнем АПФ в крови пациента с мутацией R532W.Скорость выделения мутантного АПФ в бессывороточной среде была такой же, как и для АПФ дикого типа. Однако в присутствии 10% сыворотки он был значительно выше, чем для АПФ дикого типа в тех же условиях (рис. S4A), то есть уменьшение выделения АПФ, вызванное присутствием сыворотки, было менее выражено для мутантного АПФ. .

Мы также сравнили эффекты соединения BB-94 (батимастат), а также mAb 9B9 и 3A5 с ACE ²¹ на выделение WT и мутантного ACE из клеток CHO. Воздействие этих соединений на выделение ACE в бессывороточной среде было идентичным для WT и мутантного ACE, то есть аналогичное увеличение выделения.Однако в присутствии 10% инактивированной нагреванием человеческой сыворотки влияние этих соединений на выделение АПФ было менее выраженным (примерно в два раза) для мутантного АПФ по сравнению с АПФ дикого типа (р <0,05, не показано).

Гипотеза о компонентах сыворотки, например АПФ-связывающий белок (белки), которые способны стабилизировать конформацию АПФ, предотвращая чрезмерное выделение АПФ, вероятно, позволяет нам правильно объяснить хорошо известный эффект лечения ингибиторами АПФ, а именно значительное повышение уровня АПФ в крови пациентов. ²⁵ и крысы ^26,27 .Усиление выделения АПФ из клеток СНО-АПФ и из эндотелиальных клеток ингибитором АПФ эналаприлатом наблюдалось только в присутствии сыворотки (рис. S4B), что соответствует предыдущим исследованиям изолированных эндотелиальных клеток человека ²⁸ . Мы предполагаем, что связывание ингибиторов АПФ с АПФ на поверхности эндотелиальных клеток (или на клетках СНО-АПФ), выращенных в присутствии 10% сыворотки, вызывает диссоциацию компонентов плазмы / белков из комплекса с АПФ. , что отражается в значительном увеличении связывания mAb 1G12 и 6A12 (рис.2D). Повышенная доступность эпитопов для этих mAb указывает на то, что эти эпитопы могут быть предполагаемыми сайтами связывания для этого гипотетического соединения (соединений). В результате такой диссоциации конформация АПФ может быть дестабилизирована, и скорость выделения АПФ увеличится.

Этот эффект эналаприлата (и вещества P, в качестве примера субстрата АПФ) на экспрессию АПФ и выделение АПФ был дополнительно протестирован на нескольких экспрессирующих АПФ клетках в условиях бессывороточного роста: искусственные экспрессирующие АПФ клетки, т.е.е. СНО, НЕК и эндотелиальные клетки микрососудов легких крысы (RLMVEC), трансфицированные рекомбинантным человеческим АПФ, и природные АПФ-экспрессирующие клетки, HUVEC ²⁹ . Среди этих клеток только HUVEC продемонстрировал умеренное увеличение поверхностной экспрессии АПФ на ~ 30% и значительное увеличение скорости выделения АПФ на ~ 150% после 24 часов инкубации с эналаприлатом (100 нМ) в бессывороточной среде (p <0,05, не показано), что соответствует предыдущим исследованиям изолированных эндотелиальных клеток человека ²⁸ .Поэтому мы рассматриваем этот факт как указание на то, что только HUVEC (из протестированных клеток) может экспрессировать это предполагаемое АПФ-связывающее соединение / белок, аналогично тому, что, как мы предполагаем, присутствует в плазме человека.

Таким образом, связывание ингибиторов с АПФ приводит к конформационным изменениям в молекуле АПФ (что отражается в измененном конформационном отпечатке пальца (рис. 2D). Это может вызвать диссоциацию плазменного компонента / белка из комплекса АПФ. Как следствие, АПФ конформация на клеточной мембране может быть дестабилизирована, тем самым повышая доступность АПФ для секретазы.

Еще одним аргументом в пользу гипотезы о стабилизирующем влиянии компонентов крови на конформацию и выделение АПФ является скорость выделения более короткого однодоменного тестикулярного АПФ (tACE). Сообщалось, что эта частота была в несколько раз выше по сравнению с полноразмерным двухдоменным соматическим ACE (sACE), который экспрессировался в идентичных условиях в клетках CHO ^30,31 . Авторы предположили, что N-концевой домен sACE действует как «конформационный ингибитор», который стерически препятствует доступу к области стебля для секретазы ³⁰ , или что C-концевой домен содержит мотив узнавания для секретазы ACE, который скрыт за N домен в соматическом ACE ³¹ .

Наши данные позволяют нам выдвинуть гипотезу о дополнительном объяснении гораздо более высокой скорости выделения tACE. Поскольку выделение обоих АПФ оценивалось в присутствии 10% FBS, это различие могло быть связано с менее прочным связыванием гипотетического АПФ-связывающего компонента сыворотки (АПФ-связывающий белок) с однодоменной изоформой tACE по сравнению с двухкомпонентной изоформой tACE. домен sACE, что, в свою очередь, может привести к более высокой скорости потери tACE. Таким образом, мы проверили влияние сыворотки на выделение как tACE, так и sACEs с поверхности клеток CHO — выделение полноразмерного двухдоменного ACE резко ингибировалось присутствием 10% сыворотки, 34.5 + 6,5% по сравнению с бессывороточной средой, которая была равна 20,2% / за 24 часа (рис. S3). Эффект сыворотки крови человека и крупного рогатого скота (10%) на выделение ТАСЕ (который, действительно, имел гораздо более высокую скорость выделения в бессывороточных условиях, 45,3% / за 24 часа) был гораздо менее выраженным, этот показатель равен 38,4 + 1,3% / за 24 часа в присутствии сывороток, то есть оно уменьшилось только на 15,3 + 2,6% от исходного значения (p <0,05 для влияния сывороток на sACE по сравнению с tACE). Следовательно, значительно более высокая скорость выделения тестикулярного АПФ также может быть объяснена менее эффективным связыванием предполагаемого АПФ-связывающего компонента / белка из сыворотки с однодоменным тестикулярным АПФ.

Лизоцим связывается с АПФ

Какие белки в крови потенциально связываются с АПФ на поверхности эндотелиальных клеток? Ранее сообщалось о неидентифицированном ACE-связывающем белке с массой ~ 14 кДа из крови человека ¹⁸ . Наш анализ данных протеома сыворотки человека ³² выявил несколько кандидатов на связывание АПФ, включая β2-микроглобулин (13,6 кДа), лизоцим (14,5 кДа), цистатин C (13,4 кДа), транстиретин (13,7 кДа) и сывороточный амилоидный белок A ( 13,5 кДа). Мы протестировали β2-микроглобулин и лизоцим обычными методами с использованием микротитровальных планшетов, покрытых белком, с последующей инкубацией с человеческой плазмой.Возможное связывание АПФ анализировали путем осаждения активности АПФ на иммобилизованных белках. Мы не обнаружили связывания АПФ с помощью β2-микроглобулина, в то время как мы зарегистрировали умеренное связывание лизоцима с АПФ (рис. S5A). Затем мы оценили прямое белок-белковое взаимодействие очищенного легочного АПФ с этими двумя белками плазмы с помощью поверхностного плазмонного резонанса (BIACORE). Эти исследования подтвердили, что лизоцим, но не β2-микроглобулин, связывается с человеческим АПФ (рис. S5B).

Конформация АПФ была изменена экзогенным лизоцимом человека (рис.S6), результаты заключаются в прямом взаимодействии АПФ с лизоцимом. Эпитопы для выбранных mAb, которые изменяют связывание в присутствии лизоцима, расположены как на N-, так и на C-доменах, что позволяет нам сделать вывод, что лизоцим образует комплексы с соматическим АПФ, занимая щель между доменами. Однако большинство эпитопов для этих mAb находятся в домене C, включая эпитоп для mAb 1E10, который можно рассматривать как часть стыковочной области для лизоцима.

Взаимодействие АПФ с лизоцимом, хорошо изученным белком, было неожиданным и ранее не сообщалось, возможно, что отражает слабую константу связывания взаимодействия АПФ-лизоцим с очень высокими скоростями ассоциации и диссоциации комплекса АПФ-лизоцим (рис.S5B), наблюдаемые для взаимодействий АПФ-казеинопептид ³³ . Напротив, это может отражать использование тестикулярного АПФ для коиммунопреципитации в предыдущих исследованиях ^14,15,17 , который не имеет щели между доменами. Более того, низкомолекулярные белки ¹⁴ вряд ли рассматривались в ходе экспериментов по соосаждению.

Для дальнейшей проверки взаимодействия АПФ-лизоцим мы выполнили иммунопреципитацию клеток СНО, экспрессирующих тестикулярные (tACE) или соматические (sACE) изоформы человеческого ACE, с помощью анти-ACE или анти-лизоцимных антител.Лизоцим совместно осаждали с обоими АПФ с помощью mAb против АПФ, и оба АПФ совместно осаждали с лизоцимом с помощью антител против лизоцима (фиг. 4). Проточная цитометрия клеток СНО, экспрессирующих обе изоформы АПФ с антилизоцимными моноклональными антителами (фиг. S7), показала, что клетки CHO-sACE, предварительно обработанные лизоцимом, экспрессировали на 30% большее количество лизоцима на поверхности клетки, чем клетки CHO-tACE (фиг. S7C). . Таким образом, это означает, что двудоменный АПФ обладает более благоприятной зоной стыковки для лизоцима, чем однодоменная изоформа.

Идентификация лизоцима как ACE-ассоциированного белка.

Клетки СНО, экспрессирующие тестикулярные (CHO-tACE) и соматические (CHO-ACE) изоформы ACE, предварительно инкубировали в течение ночи с лизоцимом человека или BSA (в качестве отрицательного контроля) при 250 мкг / мл. Лизаты этих клеток осаждали антителами против АПФ и лизоцима. Репрезентативный вестерн-блоттинг показал совместное осаждение АПФ и лизоцима из клеток CHO-ACE. Идентичные результаты были получены в двух дополнительных экспериментах.

Взаимодействие АПФ-лизоцим потенциально объясняет параллельное увеличение концентрации АПФ и лизоцима в крови у пациентов с саркоидозом ^34,35 и у пациентов, получающих кортикостероидную терапию ^9,35 Мы предполагаем, что лизоцим, который синтезируется и секретируется главным образом клетки миелоидного происхождения ³⁶ , связываются с АПФ, высоко экспрессируются на макрофагах и дендритных клетках внутри саркоидных гранулем ^5,20,37 . Таким образом, лизоцим может появляться на клеточной мембране в комплексе с АПФ и впоследствии попадать в кровоток вместе с АПФ.

Лизоцим регулирует выделение АПФ

Фенотипирование АПФ мышей с измененной экспрессией лизоцима показало, что активность циркулирующего АПФ снижена (в 3 раза) только в сыворотках мышей с дефицитом лизоцима М (рис. S8) по сравнению с сыворотками от мышей WT. Хотя этот результат, по-видимому, противоречит гипотезе о том, что лизоцим стабилизирует АПФ и снижает выделение АПФ, этот парадокс разрешается тем фактом, что экспрессия лизоцима P резко увеличивается у мышей с нокаутом лизоцима M ³⁸ , особенно в легких ³⁹ .Следовательно, логично заключить, что у мышей лизоцим P (не лизоцим M) может связываться с АПФ, стабилизировать его конформацию и, таким образом, уменьшать выделение АПФ.

Клетки СНО-АПФ, временно трансфицированные плазмидой, кодирующей лизоцим человека, продемонстрировали снижение (3-кратное) шедирования АПФ и реципрокное увеличение содержания АПФ на поверхности клетки (фиг. 5). Это однозначно подтверждает прямое влияние лизоцима на выделение АПФ. Этот эффект аналогичен эффекту β2-микроглобулина на увеличение поверхностной экспрессии антигена дифференцировки Т-клеток ⁴⁰ .Хотя это предположительно, опосредованное ингибитором АПФ выделение АПФ из HUVEC, наблюдаемое даже в отсутствие сыворотки (это исследование и ссылки 26,28), может отражать диссоциацию лизоцима, эндогенно экспрессируемого эндотелиальными клетками ⁴¹ , от комплекса АПФ на поверхности клетки. .

Влияние экспрессии лизоцима на выделение АПФ.

CHO — Клетки ACE временно трансфицировали плазмидами, кодирующими лизоцим человека (HLZ) или поверхностно-активный белок C (SP-C в качестве отрицательного контроля).Через 48 часов активность АПФ и экспрессию лизоцима количественно определяли в клеточных лизатах и ​​в культуральной среде. ( A ) Вестерн-блоттинг лизата и культуральной среды с антителами против лизоцима человека Ab. Положительный контроль на наличие лизоцима — жидкость бронхоальвеолярного лаважа человека (H. BALF). ( B ) Активность лизоцима мурамидазы в тех же образцах определяли с использованием убитых Micrococcus lysodeiticus . ( C ) Активность растворимого и связанного с клетками АПФ определяли с Z-Phe-His-Leu в качестве субстрата.Скорость выделения АПФ рассчитывали как активность АПФ в культуральной среде / общее количество ассоциированной с клеткой и секретируемой активности АПФ. Данные были выражены в процентах от отрицательного контроля. Среднее + стандартное отклонение трех экспериментов.

Ранее мы измерили активность АПФ в крови у разных видов животных ⁴² и обнаружили, что уровни АПФ могут различаться в 10–20 раз. Данные, представленные на фиг. S9 и S10, позволили нам сделать вывод, что различия в аминокислотных последовательностях лизоцима у разных видов могут определять способность лизоцимов связываться с АПФ и влиять на выделение АПФ.Эта модель (рис. S10) не исключает, однако, возможности для других белков крови (из списка 14 кДа) занимать щель между доменами в глобуле АПФ, а также участвовать в регуляции конформации и шедирования АПФ.

Идентификация низкомолекулярного компонента крови, который связывается с АПФ и регулирует его выделение

Мы продемонстрировали, что некоторые низкомолекулярные компоненты плазмы крови человека также связываются с человеческим АПФ, включая эндогенные ингибиторы АПФ (рис. S11), а также неидентифицированный эффектор LMW ACE, который диссоциирует от ACE крови во время фильтрации (рис.S12), диализ (фиг. S13) или разведение (фиг. 2) и изменяет связывание mAb 1G12 и 6A12 с N-доменом ACE (фиг. S12 и S13). Этот эффектор LMW ACE является гидрофобным, слабоотрицательным (фиг. S14) с молекулярной массой менее 3 кДа (фиг. S13).

Мы проверили влияние сыворотки крови человека, лишенной этого эффектора путем фильтрации через фильтр 3 кДа, на выделение АПФ из клеток CHO-ACE. Хотя фильтрат сыворотки 3 кДа сам по себе не влиял на выделение АПФ (не показано), скорость выделения АПФ была на 20-30% выше в присутствии инактивированной нагреванием сыворотки, обедненной компонентами 3 кДа, по сравнению со всей предварительно нагретой сывороткой ( Инжир.S15). Эти данные указывают на то, что специфический LMW-эффектор участвует в регуляции выделения АПФ, и комбинированный эффект лизоцима и этого нового эффектора в сыворотке крови человека на выделение АПФ более выражен, чем с одним лизоцимом. Влияние фильтрата 3 кДа плазмы человека на конформацию АПФ согласуется с этой интерпретацией: этот фильтрат изменил конформацию обоих доменов АПФ в сыворотке крови человека, содержащей лизоцим (рис. S16A), тогда как он изменил только конформацию домена N в очищенный АПФ, в основном на эпитопах mAb 1G12 и 6A12 (рис.S16B).

Влияние ингибитора АПФ, эналаприлата и ЭДТА на конформацию АПФ в крови (содержащую как лизоцим, так и эффектор АПФ с низким молекулярным весом), а также на конформацию рекомбинантного АПФ, где оба соединения отсутствуют (рис. S17), а также как эффект истощения хлоридов (рис. S18), предполагают, что диссоциация LMW эффектора АПФ потенциально зависит от нативности Zn ⁺⁺ — взаимодействие сайта связывания хлорида N домена ⁴³ .

Для идентификации LMW-эффектора (ов) АПФ, присутствующего в крови человека, 3 кДа фильтрат цитратной плазмы человека анализировали с помощью хроматографии в сочетании с анализом связывания mAb (рис.S19), а также масс-спектрометрии (таблица S1). Фракции 33–34 увеличивают преципитацию активности АПФ с помощью mAb 1G12 (рис. S19), что может быть отнесено к действию эндогенных пептидов, ингибирующих АПФ ⁴⁴ (таблица S1), тогда как фракции 36–37, напротив, снижают преципитацию АПФ. активность этого mAb. Эти фракции, таким образом, содержали неизвестный эффектор АПФ.

Анализ фракций с помощью масс-спектрометрии не позволил окончательно идентифицировать эффекторы АПФ в крови человека, поскольку было избыточное количество соединений (> 60 во фракциях 36–37, не показано).В качестве альтернативного подхода мы выполнили биоинформатический анализ метаболома человека, содержащего более 7000 соединений ⁴⁵ , и идентифицировали несколько кандидатов (Таблица S2), включая билирубин, основной кандидат из-за значительного снижения уровней АПФ в крови, наблюдаемого при желтушной кишке. пациентов, что обратно коррелирует с уровнем билирубина в крови ⁴⁶ . Один только билирубин уменьшал осаждение легочного АПФ несколькими mAb, включая mAb 1G12 и 6A12, аналогично эффекту фильтрата 3 кДа плазмы человека (рис.6A – C). Таким образом, билирубин потенциально связывается с АПФ и регулирует конформацию АПФ. Однако один билирубин (а также фильтрат 3 кДа) не влиял на скорость выделения АПФ из клеток CHO-ACE (не показано). По нашей оценке, концентрация АПФ в легких составляет ~ 130 нМ (а в крови ~ 3 нМ), а общая концентрация билирубина в крови составляет около 200 мкМ (а свободный билирубин составляет 10% от этого количества ~ 20 мкМ). предполагая возможность того, что большинство молекул АПФ связано с билирубином.Это может означать центральную роль связывания билирубина в регуляции выделения АПФ.

Влияние билирубина и 3 кДа фильтрата плазмы крови человека на связывание mAb с чистым АПФ легких человека, рекомбинантным АПФ дикого типа и мутантом R532W.

( A – C ) Преципитацию активности ACE из образцов проводили с 17 mAb к различным эпитопам человеческого ACE, как показано на фиг. 1B. ( A ) Преципитация активности ACE в легких в присутствии 150 мкг / мл билирубина выражается в процентах от таковой без билирубина.( B ) Осаждение активности ACE в легких в присутствии 80% фильтрата 3 кДа плазмы человека выражается в процентах от такового без фильтрата. ( C ) Отношение эффектов билирубина и фильтрата 3 кДа к связыванию mAb с ACE. Влияние 150 мкг / мл билирубина ( D ) и фильтрата 3 кДа плазмы человека ( E ) на преципитацию активности АПФ из растворимого рекомбинантного мутанта R532W по сравнению с АПФ дикого типа и выражается в процентах от эффекта на WT ACE.Данные представляют собой среднее значение + стандартное отклонение 3–8 экспериментов (в зависимости от mAb и типов экспериментов). Статистически значимое (p <0,05) увеличение значений более 20% от контроля выделено оранжевым цветом, уменьшение значений более 20% - желтым; снижение значений более 50% - синим цветом.

Билирубин, а также фильтрат 3 кДа плазмы изменяли связывание mAb 6A12 с мутантом ACE, R532W, намного сильнее, чем с ACE дикого типа (фиг. 6D, E). Поскольку положение R532 находится внутри эпитопа mAb 6A12 (рис.3), мы предположили, что, хотя мутация уже изменила конформацию АПФ в области эпитопа этого mAb, связывание билирубина еще больше резко изменило локальную конформацию мутантного АПФ, тем самым предотвращая связывание лизоцима с мутантным АПФ. молекулы, что, в свою очередь, привело к увеличению выделения АПФ.

Моделирование взаимодействия лизоцим-АПФ

Мы приписали одиночную замену R532W в N-домене АПФ, приводящую к значительному увеличению выделения АПФ, грубым конформационным изменениям соматического, двухдоменного АПФ и неспособности АПФ связывать компоненты крови. (например, билирубин и лизоцим), которые обычно стабилизируют конформацию АПФ на клеточной мембране.

Данные по анализу последовательности лизоцима (рис. S9), влиянию сыворотки крови человека и ее компонентов (лизоцима и низкомолекулярного фильтрата) на связывание mAb с кровью и очищенными АПФ (рис. 6, рис. S12 – S19) привели нас к предложению модели. стыковки лизоцима и билирубина с АПФ (рис. 7). В этой модели лизоцим в первую очередь связывается с областью эпитопа для mAb 1E10 в C-домене ACE и занимает щель возле моста между N- и C-доменами, касающимися эпитопов 1G12 / 6A12 в N-домене, в то время как билирубин (или билирубин конъюгаты, моно- и диглюкурониды) связывается только с N-доменом ACE, в частности, с областью эпитопа для mAb 6A12, содержащего R532W.Наши данные показывают, что лизоцим, вероятно, в комбинации с билирубином, связывается с АПФ, «скрепляя» домены вместе, и, таким образом, стабилизирует конформацию АПФ на поверхности эндотелиальных клеток, что, в свою очередь, снижает выход АПФ в кровоток.

Модель стыковки лизоцима / билирубина с соматическим АПФ.

Модель соматического АПФ человека была сконструирована с использованием модели соматического АПФ свиньи ⁵⁹ — проекции ( A , B ). Эпитопы для mAb были помечены на ACE кружками / эллипсами, соответствующими размеру эпитопа.Аминокислотные остатки на структуре лизоцима (PDB 1W08): проверенная мутация лизоцима W64 — черное пятно; кандидаты на сайты связывания с АПФ (с рис. S9 — красный). Билирубин (зеленый) покрывает R532 внутри эпитопа для mAb 6A12 и занимает промежуток между N-доменом и лизоцимом H78.

Выявленные механизмы выделения АПФ могут иметь клиническое и биологическое значение. Во-первых, это может объяснить давно наблюдаемое повышение уровня белка АПФ в крови у пациентов, получавших ингибиторы АПФ. ^25,26 .Мы предполагаем, что диссоциация комплекса лизоцим / билирубин от АПФ на сосудистой поверхности способствует конформационному изменению при связывании ингибитора АПФ, что впоследствии приводит к увеличению выделения АПФ еще не идентифицированной секретазой.

Гипотеза АПФ-лизоцим / билирубин может объяснить парадоксальное одновременное увеличение концентрации вещества Р и АПФ у пациентов с мигренью ⁴⁷ : связывание вещества Р (субстрат АПФ) с АПФ также вызывает диссоциацию лизоцима / билирубина от АПФ, таким образом, что приводит к более высокому уровню выделения АПФ.

Наши данные могут также объяснить низкий уровень АПФ в моче ⁴² , несмотря на высокую экспрессию АПФ в эпителиальных клетках проксимальных канальцев ⁵ . Поскольку лизоцим свободно фильтруется в клубочках, а реабсорбция происходит почти исключительно в проксимальных канальцах ⁴⁸ , огромная концентрация лизоцима там может стабилизировать АПФ на поверхности эпителиальных клеток канальцев, тем самым предотвращая выделение АПФ в мочу.

Наконец, гипотеза АПФ-лизоцима может объяснить параллельное увеличение уровней лизоцима и АПФ в крови, наблюдаемое у пациентов с саркоидозом, системным гранулематозным заболеванием. ^9,34,35 .Лизоцим можно просто пролить с поверхности дендритных клеток в кровь в виде комплекса с АПФ, концентрация которого чрезвычайно высока на этих клетках ^20,37 .

В заключение, мы идентифицировали новую мутацию АПФ, R532W, которая связана с повышенным уровнем АПФ в крови. Билирубин и лизоцим были идентифицированы как новые АПФ-связывающие компоненты крови, которые действуют согласованно, регулируя конформацию АПФ и, возможно, влияя на выделение АПФ.