Дюсш 70 молния: 70 , , , 13, , , , , , -, , , -, , , , —

Отдел продаж принес пользу только директору бассейна! Сопляку 31 год, к спорту отношения никакого не имел никогда, с его приходом школа пришла в упадок и разруху. У него одна цель выжать прибыль для себя, оборудование все изношенное, люди обжигаются кипятком в душевых кабинах, из-за сломанного оборудования. Посмотрите на грибок на стенах и швах чаши бассейна. А ведь там плавают наши дети! Сколько не пиши жалоб в жалобную книгу -…
Показать полностьюОтдел продаж принес пользу только директору бассейна! Сопляку 31 год, к спорту отношения никакого не имел никогда, с его приходом школа пришла в упадок и разруху. У него одна цель выжать прибыль для себя, оборудование все изношенное, люди обжигаются кипятком в душевых кабинах, из-за сломанного оборудования. Посмотрите на грибок на стенах и швах чаши бассейна. А ведь там плавают наши дети! Сколько не пиши жалоб в жалобную книгу — реакция нулевая.

ДЮСШ №70 «МОЛНИЯ»

Команда И В Н П М О  МОЛНИЯ 0 0 0 0 0:0 0  ДЮСШ 82 0 0 0 0 0:0 0  Кр. Октябрь 0 0 0 0 0:0 0  МКМ 0 0 0 0 0:0 0  Красногвардеец 0 0 0 0 0:0 0  Красногвардеец-2 0 0 0 0 0:0 0  Крылатское 0 0 0 0 0:0 0

Новости 01. 03.2012г. Новости 01.03.2012г. Новости 01.03.2012г. Новости

ГБУ «СШОР №70 «МОЛНИЯ» МОСКОМСПОРТА — Москва

1.

№ 771802036237 от 26 октября 2018 года Внеплановая выездная проверка Орган контроля (надзора), проводящий проверку Главное управление МЧС России по г. Москве Цель проверки Контроля за исполнением предписания ГПН №71/1/1 от 09.08.2017г об устранении нарушений требований пожар-ной безопасности, о проведении мероприятий по обеспечению пожарной безопасности на объектах защиты и по предотвращению угрозы возникновения пожара

Результат Нарушений не выявлено Информация о результатах проверки 1. Указание на отсутствие выявленных нарушений обязательных требований или требований, установленных муниципальными правовыми актами (в случае если нарушений обязательных требований или требований, установленных муниципальными правовыми актами, не выявлено) Не выявлено

2.

№ 771800217751 от 19 марта 2018 года Внеплановая документарная проверка Орган контроля (надзора), проводящий проверку Департамент здравоохранения города Москвы Цель проверки — оценка соответствия сведений о лицензиате, содержащихся в представленных им заявлении и документах, положениям части 3 статьи 18 Федерального закона от 04.05.2011 № 99-ФЗ «О лицензировании отдельных видов деятельности», а также сведениям о лицензиате, содержащимся в едином государственном реестре юридических лиц/индивидуальных предпринимателей и других федеральных информационных ресурсах. Задача: — установление полноты и достоверности сведений о лицензиате, содержащихся в заявлении и документах. Предмет: — соответствие сведений, содержащихся в заявлении и документах юридического лица или индивидуального предпринимателя о предоставлении специального разрешения (лицензии) на право осуществления отдельных видов деятельности, если проведение соответствующей внеплановой проверки юридического лица, индивидуального предпринимателя предусмотрено правилами предоставления специального разрешения (лицензии), обязательным требованиям, а также данным об указанных юридических лицах и индивидуальных предпринимателях, содержащимся в едином государственном реестре юридических лиц, едином государственном реестре индивидуальных предпринимателей и других федеральных информационных ресурсах

Результат Нарушений не выявлено Информация о результатах проверки 1. Указание на отсутствие выявленных нарушений обязательных требований или требований, установленных муниципальными правовыми актами (в случае если нарушений обязательных требований или требований, установленных муниципальными правовыми актами, не выявлено) Нарушений не выявлено 2. Сведения об ознакомлении или отказе ознакомления с актом КНМ руководителя, иного должностного лица или уполномоченного представителя юридического лица, индивидуального предпринимателя, его уполномоченного представителя, присутствовавших при проведении КНМ, о наличии их подписей или об отказе от совершения подписи Ознакомлен и подписал акт по доверенности Баньковский В.А.

3.

№ 77180803095682 от 22 февраля 2018 года Внеплановая выездная проверка Орган контроля (надзора), проводящий проверку Государственная жилищная инспекция города Москвы Цель проверки Проверка исполнения ранее выданного предписания; № Р-О-С-07559-ОО/1 от 20. 02.2018

Результат Нарушений не выявлено

4.

№ 77180803086314 от 14 февраля 2018 года Внеплановая выездная проверка Орган контроля (надзора), проводящий проверку Государственная жилищная инспекция города Москвы Цель проверки Проверка исполнения ранее выданного предписания; № Р-О-С-05624-ОО/1 от 03.02.2018

Результат Нарушений не выявлено

5.

№ 77180803088345 от 5 февраля 2018 года Внеплановая выездная проверка Орган контроля (надзора), проводящий проверку Государственная жилищная инспекция города Москвы Цель проверки Проверка исполнения ранее выданного предписания; № Р-О-С-05612-ОО/1 от 22.01.2018

Результат Нарушений не выявлено

Справочник футбольных школ Москвы | Московская федерация футбола

СПОРТИВНАЯ ШКОЛА	АДРЕС (тел/факс/эл. почта)	ДИРЕКТОР	СТ. ТРЕНЕР тел	Домашний стадион	АДРЕС (телефон)
ЧУДО «Академия «Спартак» по футболу им. Ф.Ф. Черенкова»	г. Москва, Мал. Олений пер.23, 8-499-268-88-77 факс 8-499-268-13-20 [email protected]	Сидоров Дмитрий Евгеньевич	Бодров Владимир Васильевич	ООО Стадион «Спартак»;	М. Олений пер., Владение 3 8-499-268-14-67
НОУ ЦСО «Локомотив»	г. Москва, ул. Б. Черкизовская, д. 125, стр. 2 и 9 8-499-161-03-12 факс [email protected]	Кузьмичев Владимир Семенович	Ульянов Николай Михайлович	Малая спортивная арена «Локомотив»;	ул. Б. Черкизовская, д. 125
АНО «Футбольная академия «Динамо» имени Л.И. Яшина»	г. Москва, Лужники 24 стр. 3 [email protected] [email protected]	Кузнецов Александр Юрьевич	Чикишев Сергей Николаевич	«Северное спортивное ядро» Лужники	г. Москва, ул.Лужники 24 стр. 3 8-495-780-08-08
АНО ДЮСШ ПФК ЦСКА	г. Москва, Ленинградский пр-т, вл. 39, стр. 1 8-499-728-62-40 [email protected]	Корнаухов Олег Дмитриевич	Никитин Сергей Иванович	«Октябрь»	ул.Живописная 21
ГБОУ ЦCО «Чертаново»   «Чертаново-2»	г. Москва,  ул. Чертановская, д. 7-3 8-495-311-62-12(доб.45) [email protected]	Ларин Николай Юрьевич	Бабенко Николай Петрович [email protected] Цуцков Алексей Вячеславович [email protected]	«Арена Чертаново»	Москва, Сумской пр-д влад.26
НОУ ЦСО «Локомотив-2»	г. Москва, ул. Б. Черкизовская, д. 125, стр. 2 и 9. [email protected]	Кузьмичев Владимир Семенович	Илялетдинов Хабиб Хасибович	«Локомотив» Перово	ул. Лазо, д. 17а. 8-495-309-20-54
СШОР «Юность Москвы» по футболу «Спартак-2»	г. Москва, ул. 3-я Гражданская д. 47А [email protected]	Лёвин Игорь Вячеславович	Смирнов Игорь Борисович	Стадион «Спартаковец» им. Н.П. Старостина	ул. 3-я Гражданская, д. 47
ГБУ ФК «ФШМ» Москомспорта	г. Москва, ул. Радио, д.10, стр.9 [email protected]	Милешкин Евгений Юрьевич	Киселев Николай Иванович	«Лужники»	Лужнецкая наб, д. 24 8-495-637-01-08
СШОР «Юность Москвы» по футболу «Торпедо»	г. Москва, ул. Восточная, д. 4 А 8-495-675-72-33 факс torpedoschool@yandex. ru	Макаров Геннадий Борисович	Полукаров Александр Васильевич	Спортивный комплекс им. Э.А. Стрельцова.	ул. Восточная, д.4А 8-495-675-39-07
ГБУ ФК «Строгино» «Строгино-2»	г. Москва, 121500, ул. Василия Ботылева, д. 41   [email protected]	Струтынский Дмитрий Андреевич	Загидуллин Сергей Рафхатович	«Янтарь»     «Рублево»	ул. Маршала Катукова, д. 26   Ул.В.Ботылева 41 8-499-727-40-05
ГБОУ СШОР № 63 «Смена» «Смена-2» Москомспорта	109429, г. Москва, Капотня, 2-й квартал, д. 2А, стр. 1 8-495-355-22-57 [email protected] 8-495-355-22-57	Полищук Андрей Олегович	Ещенко Юрий Валентинович   Юрцев Павел Викторович	«Труд» Капотня	Капотня, 2-й квартал, д. 2А, стр. 1 8-495-355-22-57
ГБОУ СШОР № 44 «Красногвардеец» «Красногвардеец – 2»	г. Москва, ул Лисичанская, д. 3. 8-495-321-66-55 8-495-325-16-34 факс [email protected]	Ичетовкин Дмитрий Леонидович	Макаров Андрей Михайлович	«Борисовские пруды»	ул. Борисовские пруды, вл. 2
СДЮСШОР «Химки» г. Химки	МО, г.Химки, ул. Машинцева, д. 2 [email protected]	Киселев Александр Анатольевич	Егоркин Сергей Александрович	«Новые Химки»	г.Химки, ул. Машинцева, д. 2 8-495-793-09-96
ДЮСШ «Приалит Реутов	г. Реутов, ул. Новая, д. 1а 8(495)528-84-72 [email protected]	Алиферов Максим Робертович	Зюзин Максим Васильевич	«Старт» г. Реутов	ул. Новая, д. 1а
ГБУ СШ № 57 «Крылья Советов» «Крылья Советов-2» «Крылья Советов-3»	г.Москва, ш.Энтузиастов д. 54 тел/факс 495-672-34-72 s57@mossport. ru	Алтабаев Андрей Николаевич	Морозов Владислав Владимирович   Крылов Станислав Сергеевич   Юдин Александр Семенович	«Крылья Советов»   «Спартаковец»	пр. Буденного 17 а   3-я Гражданская 47а
ГБУ СШ № 75 «Савеловская-2»	г. Москва, Бескудниковский  б-р, д. 12А 8-495-685-82-77 [email protected]	Акуненко Александр Владимирович	Беляев Василий Юрьевич	«Автомобилист»	Ул. Вятская 41
ГБУ СШ № 112 «Спутник» Москомспорта	124617, г. Москва, г. Зеленоград, корп. 907 [email protected]	Кулин Николай Александрович	Зиновьев Александр Викторович	«Ангстрем»	г. Зеленоград, Озерная аллея 3
Спортивная школа «Юность Москвы» по футболу «Буревестник»	г. Москва, ул. Сельскохозяйственная д. 26 f.c.burevestnik@yandex. ru	Шавейко Валерий Иванович	Турчанинов Антон Игоревич	«Искра»	ул. Сельскохозяйственная д. 26
ГБУ СШОР № 27 «Сокол» Москомспорта	г. Москва, ул. Верхняя Красносельская, д. 7-a 8-499-264-41-74; [email protected]	Акуненко Дмитрий Владимирович	Иванов Андрей Иванович	Арена «Сокол»	Новорязанская-29
ГБУ СШ № 4 Москомспорта	г. Москва, ул. 1-я Вольская д. 15, корп. 1 8-499-211-25-80 факс [email protected]	Спиридонов Михаил Владимирович	Волков Юрий Рефович	ГБУ СШ №4	ул. 2-я Вольская, д. 16 8-499-211-25-79
МУ «Центр Спорта «Московский» ФК «Росич»	г. Москва г. Московский, мкр. 1, д. 39А 8-495-841-08-69 факс 8-495-841-97-75 [email protected]	Чирин Александр Владимирович	Никитин Дмитрий Валентинович	«Московский»	г. Москва г. Московский, мкр. 1, д. 39А   8-495-841-97-75
ДЮСШ «Воробьевы горы»	Ул. Косыгина 17 8-499-137-73-91 [email protected]	Афанасьев Андрей Геннадьевич	Хамзин Сабир Ширбалаевич	Воробьевы горы	Ул.Косыгина 17
ГБУ СШОР «Москвич» Москомспорта	г. Москва, Волгоградский пр-т, д.46/15 8-499-179-08-01 [email protected]	Яровов Иван Сергеевич 8-499-179-08-01	Трипольев Василий Иванович	«Москвич»	Волгоградский пр-т, д. 46/15
РОО ЦДФП «Мегасфера» «Мегасфера-2»	ул. Академика Варги 3 8-965-396-88-27	Алеев Ахмет Альбертович	Стефаненко Павел Васильевич	«Школа №1100»;  Стадион МГИМО	ул. Академика Челомея, д. 6А; Пр-т Вернадского Дом. 76
ГБУ САШ «Олимпик» Москомспорта	127543, г. Москва, ул.Корнейчука, д. 28, корп. 2 8-495-707-05-83; 8-495-707-05-81 факс [email protected]	Петров Сергей Иванович	Агишев Рифат Адильшаевич	Свиблово.	Тенистый вал дом 6
ГБУ СШ № 70 «Молния»	127644, г. Москва, ул. Лобненская, д.13А 8-495-483-35-04; 8-495-483-59-59 [email protected]	Черкесов Тимур Черкесович	Чекмарев Вячеслав Валерьевич	«Молния»	ул. Лобненская, д.13 А
СШОР «Юность Москвы» -«Кунцево»	г. Москва, Можайское шоссе д. 7 8-495-651-99-86; [email protected]	Кабанов Игорь Александрович	Калинин Дмитрий Геннадьевич	«Кунцево»	Можайское ш. 7
СШОР «Юность Москвы» по футболу «Торпедо-2»	г. Москва, Волоколамское ш.88 [email protected]	Макаров Геннадий Борисович	Великий Сергей Петрович	«Луч»	Волоколамское ш.88
МФСК «Юный Динамовец»	г. Москва, Лесная д.6 8-495-775-45-94 (доб.10346) [email protected]	Долгушев Анатолий Петрович	Шелия Зураб Зурабович	«Луч»	Волоколамское ш.88
ГБУ СШ № 75 «Савеловская» Москомспорта	г. Москва, ул. Вятская, д. 41 8-495-685-82-77 [email protected]	Акуненко Александр Владимирович	Чудин Сергей Сергеевич	«Автомобилист».	Ул. Вятская 41
ФК «Митино»	г. Москва, ул. Дубравная, д. 41, к. 4 8-965-371-93-10 [email protected]	Скрипкин Сергей Андреевич	Скрипкин Сергей Андреевич	ГБОУ СОШ № 1900 ФК «МИТИНО»	г. Москва, ул. Дубравная, д. 41, к. 4
ГБУ «Спортивная школа № 82» Москомспорта	г. Москва, ул. Инженерная, д. 5, стр. 1; 8-499-900-98-63	Карапузов Александр Васильевич		ЦСП «Крылатское»	Москва,ул.Западная дом 16 б
ГБУ СШ №101 «Тушино» Москомспорта	г. Москва, ул. Сходненская, 15 8-495-490-16-81 [email protected] [email protected]	Казадой Сергей Михайлович	Багдасарьян Юрий Викторович   [email protected]	«Салют»	Ул.Лодочная д.15 стр. 1А
ДЮСШ-2-Дина г.Троицк	г.Москва г. Троицк мкр «В» д. 6-а 8-495-851-21-90 [email protected]	Прохода Владимир Владимирович	Рожков Валерий Михайлович	Городской стадион	Троицк, Октябрьский пр-т Д.14
ЧУДО ДЮСШ «МКМ»	г. Москва, ул. 2-я Кабельная, д. 2 8-495-673-82-17 8-495-361-45-25 факс [email protected]	Ломасова Елена Ивановна	Бедняшин Александр Николаевич	Стадион парка «Таганский»	Ул. Таганская Дом.40/42
ДЮСШ СК «МВА»	г. Москва, ул. Академика Скрябина, д. 23/2 8-495-377-72-84 факс [email protected]	Малютин Игорь Борисович	Тетерюков Александр Иванович	Спортивный комплекс «МВА»	ул. Академика Скрябина, д. 23/2.
ГБУ СШОР № 46 Москомспорта	г. Москва, ул. 3-я Радиальная, 8 [email protected] 8-499-321-50-66	Зайнетдинов Марат Валерьевич	Бабаян Роберт Бабкенович	«Борисовксие пруды»	Ул. Борисовксие пруды влад. 2
«Родина»	1-й Боткинский пр-д д.7 стр.1 8-925-829-62-62 larchelena@yandex. ru	Попов Ярослав Владимирович	Ларченкова Елена Михайловна	ЦСКА	3-я Песчаная ул. Влад.2
Сборная Москвы (девушки)	[email protected]		Табынбаев Алим Тайбазарович	«Арена Чертаново»	Москва, Сумской пр-д влад.26
ГБУ «СШОР Трудовые резервы» Москомспорта	Ул.Нижняя Первомайская 52 [email protected] [email protected]	Лексин Сергей Федорович	Евсеев Владимир Петрович   Агапов Сергей Владимирович	ЦСП «Крылатское»	П-к Восточный
КП «СК ОД-80»	119602, Мичуринский пр-кт , Олимпийская деревня д 2 [email protected]	Кузнецов Дмитрий Валерьевич	Шишелов Владимир Александрович	СК «Олимпийская деревня»	Мичуринский пр-кт , Олимпийская деревня д 2
«ФК Салова»	Лужнецкая наб. 24 [email protected]	Салов Евгений Геннадьевич	Салов Геннадий Вячеславович	АО «Лужники»	Лужнецкая наб.24
«Спарта-Свиблово»	Берингов проезд 3 8-499-186-81-83 [email protected]	Мирзаходжаев Кудрат Махамадалиевич	Халапурдин Виктор Егорович [email protected]	СК «Свиблово»	Тенистый проезд 6
«АФМ «Авангард»	Ул. Южнобутовская д.101 8-495-215-20-27 [email protected]	Кузьмин Александр Сергеевич	Садиков Марат Рустямович	«Труд»	Варшавское ш. 14

О передаче ГОУ ДОДСН «ДЮСШ N 70 «Молния» на праве оперативного управления физкультурно-оздоровительных комплексов (с изменениями на 15 июня 2010 года), Распоряжение Правительства Москвы от 27 апреля 2009 года №785-РП

РАСПОРЯЖЕНИЕ

от 27 апреля 2009 года N 785-РП

О передаче ГОУ ДОДСН «ДЮСШ N 70
«Молния» на праве оперативного управления
физкультурно-оздоровительных комплексов

(с изменениями на 15 июня 2010 года)

____________________________________________________________________
Документ с изменениями, внесенными:
распоряжением Правительства Москвы от 15 июня 2010 года N 1154-РП (Вестник Мэра и Правительства Москвы, N 36, 29. 06.2010).
____________________________________________________________________

В целях укрепления материально-технической базы Государственного образовательного учреждения дополнительного образования детей спортивной направленности города Москвы «Детско-юношеская спортивная школа N 70 «Молния» Департамента физической культуры и спорта города Москвы» и эффективного использования физкультурно-оздоровительных комплексов:

1. Принять предложение Департамента физической культуры и спорта города Москвы и префектуры Северного административного округа города Москвы о передаче после государственной регистрации права собственности города Москвы Государственному образовательному учреждению дополнительного образования детей спортивной направленности города Москвы «Детско-юношеская спортивная школа N 70 «Молния» Департамента физической культуры и спорта города Москвы» (ГОУ ДОДСН «ДЮСШ N 70 «Молния») на праве оперативного управления физкультурно-оздоровительных комплексов:

1. 1. С бассейном общей площадью 1975,0 кв.м по адресу: ул.Лобненская, вл.13Б.

1.2. С катком общей площадью 3760,0 кв.м по адресу: ул.Лобненская, вл.13А.

2. Установить, что заказчик ОАО «Москапстрой» представит в Департамент имущества города Москвы необходимые пакеты документов для внесения физкультурно-оздоровительных комплексов (п.1) в Реестр объектов недвижимости, находящихся в собственности города Москвы, и передачи их на баланс Департамента имущества города Москвы.

3. ГОУ ДОДСН «ДЮСШ N 70 «Молния»:

3.1. Представить в Департамент имущества города Москвы необходимые пакеты документов для оформления контрактов на право оперативного управления физкультурно-оздоровительными комплексами (п.1).

3.2. Зарегистрировать в установленном порядке право оперативного управления физкультурно-оздоровительными комплексами (п.1).

4. Департаменту имущества города Москвы после представления необходимых пакетов документов (пп. 2, 3.1):

4.1. Внести физкультурно-оздоровительные комплексы (п.1) в Реестр объектов недвижимости, находящихся в собственности города Москвы.

4.2. Принять на баланс физкультурно-оздоровительные комплексы (п.1) со смонтированным и установленным в них оборудованием и мебелью от ОАО «Москапстрой».

4.3. Оформить ГОУ ДОДСН «ДЮСШ N 70 «Молния» передачу физкультурно-оздоровительных комплексов (п.1) в установленном порядке.

4.4. Передать физкультурно-оздоровительные комплексы (п.1) со смонтированным и установленным в них оборудованием и мебелью на баланс ГОУ ДОДСН «ДЮСШ N 70 «Молния».

4.5. Уточнить адреса и площади физкультурно-оздоровительных комплексов (п.1) на основании документов ГУП МосгорБТИ.

5. Установить срок выполнения распоряжения в целом до 30 декабря 2012 года (пункт дополнительно включен на основании распоряжения Правительства Москвы от 15 июня 2010 года N 1154-РП).

____________________________________________________________________
Пункт 5 предыдущей редакции считается пунктом 6 настоящей редакции — распоряжение Правительства Москвы от 15 июня 2010 года N 1154-РП.

____________________________________________________________________

6. Контроль за выполнением настоящего распоряжения возложить на заместителя Мэра Москвы в Правительстве Москвы по вопросам межрегионального сотрудничества, спорта и туризма Байдакова С.Л. и заместителя Мэра Москвы в Правительстве Москвы Силкина В.Н.

Мэр Москвы
Ю.М.Лужков

Редакция документа с учетом
изменений и дополнений подготовлена
АО «Кодекс»

Департамент физической культуры и спорта города Москвы (Москомспорт)

Связанные документы → Страница 10

Распоряжение Правительства Москвы № 1029-РП от 22 мая 2009 года

О передаче ГОУ ДОДСН «СДЮСШОР N 33» на праве оперативного управления физкультурно-оздоровительного комплекса по адресу: ул. Кравченко, вл. 6

Распоряжение Правительства Москвы № 1024-РП от 22 мая 2009 года

О передаче ГОУ ДОДСН «ДЮСШ N 35» на праве оперативного управления физкультурно-оздоровительного комплекса по адресу: ул. Новочеремушкинская, вл. 64, корп. 6

Распоряжение Правительства Москвы № 1023-РП от 22 мая 2009 года

О передаче ГОУ Центру образования «Самбо-70» на праве оперативного управления физкультурно-оздоровительного комплекса по адресу: ул. Кулакова, вл. 15

Распоряжение Правительства Москвы № 1012-РП от 21 мая 2009 года

О реорганизации Государственного образовательного учреждения «Московское среднее специальное училище олимпийского резерва N 4» Департамента физической культуры и спорта города Москвы

Постановление Московской городской Думы № 146 от 13 мая 2009 года

Об отзыве на проект федерального закона N 170018-5 «О внесении изменений в Федеральный закон «О физической культуре и спорте в Российской Федерации»

Постановление Правительства Москвы № 402-ПП от 12 мая 2009 года

О совершенствовании системы физического воспитания и массового спорта среди детей и учащейся молодежи города Москвы

Распоряжение Правительства Москвы № 883-РП от 8 мая 2009 года

О подготовке и проведении этапа Кубка мира по спортивной гимнастике «Звезды мира»

Распоряжение Правительства Москвы № 845-РП от 5 мая 2009 года

О передаче ГОУ ДОДСН СДЮСШОР N 73 «Виктория» на праве оперативного управления физкультурно-оздоровительного комплекса по адресу: ул. Алабяна, д. 13, корп. 1

Распоряжение Правительства Москвы № 803-РП от 28 апреля 2009 года

О подборе земельного участка и разработке документации по планировке территории для размещения лыжно-спортивной базы Государственного образовательного учреждения дополнительного образования детей спортивной направленности города Москвы «Детско-юношеская спортивная школа N 102 Департамента физической культуры и спорта города Москвы»

Распоряжение Правительства Москвы № 785-РП от 27 апреля 2009 года

О передаче ГОУ ДОДСН «ДЮСШ N 70 «Молния» на праве оперативного управления физкультурно-оздоровительных комплексов

Распоряжение Правительства Москвы № 784-РП от 27 апреля 2009 года

О передаче Департаменту физической культуры и спорта города Москвы на праве оперативного управления нежилых помещений по адресу: 3-й Хорошевский пр., д. 4

Указ мэра Москвы № 27-УМ от 27 апреля 2009 года

О присвоении почетного звания «Почетный работник физкультуры, спорта и туризма города Москвы»

Распоряжение Правительства Москвы № 696-РП от 20 апреля 2009 года

О реализации проекта строительства многофункционального спортивно- выставочного центра по адресу: ул. Лужники, вл.24

Распоряжение Правительства Москвы № 586-РП от 6 апреля 2009 года

О реорганизации государственных образовательных учреждений дополнительного образования детей спортивной направленности Департамента физической культуры и спорта города Москвы

Распоряжение Правительства Москвы № 568-РП от 3 апреля 2009 года

О передаче Департаменту физической культуры и спорта города Москвы на праве оперативного управления нежилых помещений

Распоряжение Правительства Москвы № 566-РП от 3 апреля 2009 года

Об утверждении акта разрешенного использования участка территории градостроительного объекта (земельного участка) для осуществления строительства школы спортивных танцев по адресу: ул. Крылатская, вл. 23А

Постановление Правительства Москвы № 259-ПП от 31 марта 2009 года

О передаче ГОУ МССУОР N 2 Москомспорта на праве оперативного управления подземного гаража по адресу: ул. Малая Филевская, д.34, корп.1

Распоряжение Правительства Москвы № 518-РП от 27 марта 2009 года

О передаче ГОУ МССУОР N 1 Москомспорта на праве оперативного управления физкультурно-оздоровительного комплекса по адресу: ул.16-я Парковая, вл.11

Постановление Правительства Москвы № 233-ПП от 24 марта 2009 года

О передаче Государственному учреждению города Москвы «Центр физической культуры и спорта Центрального административного округа города Москвы» Департамента физической культуры и спорта города Москвы на праве оперативного управления нежилых помещений по адресу: 2-й Щемиловский пер.,д.16/20

Распоряжение Правительства Москвы № 388-РП от 6 марта 2009 года

Об участии в подготовке и проведении ХI открытого московского международного турнира по спортивным танцам — «Танцфорум-2009»

41 страница

← 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 →

Смотрите также

Департамент физической культуры и спорта города Москвы (Москомспорт)

Окружные управления физической культуры и спорта (УФКиС) города Москвы

Власти районного уровня Москвы

Власти окружного уровня Москвы

Московские органы власти

Федеральные органы власти

Правовые акты (Нормативная база) Москвы

Почему футбольные тренеры ведут себя как сопливые девочки

Принято считать, что футбол — это не балет для сопливых девочек.

Сразу предупрежу: слабонервным лучше дальше не читать!

Почему никто не хочет победы «Ростова» в чемпионате России

«Почему этот выродок, Кубышкин Виктор Владимирович, до сих пор тренер футболистов? Его сажать надо, а ему детей доверяют. А потом вырастают не футболисты, а говно костоломное». Такое сообщение (и ссылка на видео, которое один из юных футболистов команды снял на телефон в раздевалке после проигранного матча) на этой неделе появилось на форуме московской ДЮСШ № 70 «Молния». На сайте гордо висит полотнищем несколько корявый слоган этой школы:

«Грохочет гром, дрожит земля,

На поле «Молния» Москва!»

Как грохочет гром и дрожит земля, понятно из этого видео.

Тренер негодовал (привожу его речь почти целиком, только заменив бранные слова на цензурные): «Раз уж такая каша пошла, я выпускаю специально вас: одного, второго и третьего. Задача какая была у вас? Спровоцировать драку на поле, женщина легкого поведения! Была бы драка — с нас бы очки сняли, но и с них, и они бы остались с голой частью тела ниже спины! Трусы, женщина легкого поведения… А как в прошлом году с «Кунцево» — у них шестерых удалили — и у нас, у них очки сняли — и у нас. Дебилы, блин! Я вам говорю: вышли бы и провоцировали, имею вид на проживание с вашей мамой. Уроды, блин. Больше не ходите сюда (тут я затрудняюсь отредактировать текст точно, но пусть будет так) — ни за что на свете! Страдающие недержанием, подвергшиеся насилию. Я же вам кричал: «Зачем я вас выпустил на поле?» Все слышали? Вот ты, зачем я тебя выпустил на поле? Чтобы ты бегал? Трусы носил? Страдающий недержанием, подвергшийся насилию, женщина легкого поведения!

Там стоят рядом два их тренера, я не могу вам еще раз кричать: сильно ударь его, блин! Мозги куриные, блин. Вышли они в футбол играть, женщина легкого поведения, рады — выпустили их! Вот ты вышел, какого лешего ты бегаешь вперед? Встал сзади — и как сильно ударил кому–нибудь по колену, чтобы его вынесли с поля как можно дальше».

Я специально привел разбор игры детским футбольным тренером с игроками так подробно, чтобы вы смогли осознать всю глубину проблемы.

Почему футбольным клубам не обязательно что-то выигрывать, чтобы много зарабатывать

После появления этого видео Москомспорт уволил тренера Виктора Кубышкина, а в апреле состоится заседание Контрольно–дисциплинарного комитета Федерации футбола Москвы, на котором будет рассматриваться вопрос о бессрочной (пожизненной) дисквалификации тренера на территории Москвы.

Но есть у красноречивого тренера и сторонники. Например, его бывшие воспитанники, которые высказались в его защиту на сайте sports.ru:

«Хороший он мужик — строгий и немного грубый, но c командами своего года всегда был в призовых местах любой лиги! На сборах в 50 лет летал, так еще и фору нам давал! Всегда горой за свой коллектив. Да, конечно, особой технике он не учил, но физуху, мощь и характер всегда ставил на первое место».

«Выпивал частенько и на тренировках, и на сборах. В принципе у него всегда были такие методы воспитания — футбол «бей–беги». Упор он всегда делал на физику, что лично я считаю в корне неправильным — техника должна закладываться в детстве.

Случаев с ним разных множество, но мне, если честно, не очень хочется все это поднимать сейчас: методы его, понятно, для детско–юношеского футбола не подходят, но как–никак он нас воспитывал и тренировал, и уважение к нему осталось, хоть и считаю, что во многом он не прав!»

«Блогер с дипломом журналиста» Роман Герасимов на сайте sports. ru тоже высказался: «Футбол, невзирая на возраст участников процесса, никогда не являлся и не будет балетом для сопливых девочек. Не для тупых футбол, чтобы вы знали. Вам скажут прыгать с крыши — прыгайте, вперед. Скажут «ломать» соперника — «ломайте», ради бога, если вы идиот, а своя голова на плечах лишь для регулярного приема пищи. Вопрос ума, сугубо мотивационный. Логика понятна?

«Любимые» и сидячие на плоских ж… моралисты, расскажите–ка мне в комментариях о нормах общения в мужских спортивных коллективах. Только все, что вы напишете ниже, будет использовано против ваших тощих и дряблых задниц, потому что не имеет ничего общего со спортом».

И вот она, главная проблема — и в таких детских тренерах, и в таких его защитниках. Виктор Кубышкин — отнюдь не уникальный детский тренер, который разговаривает с игроками матом и требует, чтобы они разбили сопернику колено и спровоцировали драку.

В комментариях на разных сайтах родители юных футболистов стали вспоминать, когда у кого тренер приходил на тренировку пьяный, как часто не стесняется выражений.

Буквально на следующий день появилось другое видео: после матча футбольных команд девочек. Тренер проигравшей команды, не стесняясь ни девочек из своей команды, ни их соперниц, ни родителей, ни зрителей, ни судей, прямо на поле высказывается в адрес тренера команды–победительницы и судей: «Чмо, человек нетрадиционной сексуальной ориентации конченый. Отсосал? Первое место занял? Вы все люди нетрадиционной сексуальной ориентации. А телки ваши — девушки нетрадиционной сексуальной ориентации».

Распространенное мнение, конечно, что футбол — не балет для сопливых девочек. Но если вы посмотрите на истерику проигравшего тренера, то сопли как раз впору вытирать ему.

Выделите фрагмент с текстом ошибки и нажмите Ctrl+Enter

Ген Mi устойчивости к нематодам корневого узла из помидоров является членом лейциновой молнии, связывания нуклеотидов, семейства богатых лейцином повторов генов растений

Abstract

Локус Mi томата придает устойчивость к нематодам корневых узлов. ДНК томатов, охватывающую локус, выделяли в виде клонов искусственных хромосом бактерий, и секвенировали 52 т.п.н. непрерывной ДНК. Были идентифицированы три открытые рамки считывания по сходству с клонированными генами устойчивости растений к болезням.Два из них, Mi-1.1 и Mi-1.2 , по-видимому, являются интактными генами; третий — псевдоген. В корнях томатов присутствует мРНК размером 4 т.п.н., гибридизирующаяся с этими генами. Исследования комплементации с использованием клонированных копий Mi-1.1 и Mi-1.2 показали, что Mi-1.2 , но не Mi-1.1 , достаточно для придания устойчивости чувствительной линии томатов с потомством трансформантов, разделяющих на сопротивление. Клонированный ген наиболее похож на Mi-1.2 — это Prf , ген томата, необходимый для устойчивости к Pseudomonas syringae. Prf и Mi-1.2 имеют несколько общих структурных мотивов, включая сайт связывания нуклеотидов и богатую лейцином область повтора, которые характерны для семейства растительных белков, включая несколько, которые необходимы для устойчивости к вирусам, бактериям, грибам и т. Д. , нематоды.

ВВЕДЕНИЕ

Нематоды корневых узлов составляют группу эндопаразитических круглых червей, которые наносят значительный экономический ущерб посевам во всем мире (Williamson and Hussey, 1996).Эти микроскопические организмы проникают в корни тысяч видов растений и мигрируют в сосудистый цилиндр, где инициируют серию изменений в корне, что приводит к образованию галлов (или корневых узлов), а также к развитию специализированных питающих клеток, называемые «гигантскими клетками» в своих хозяевах. Эти изменения сильно влияют на распределение питательных веществ и поглощение воды в организме хозяина.

Многие современные сорта томатов несут единственный доминантный ген, называемый Mi. Этот ген придает устойчивость к трем из наиболее вредных видов нематод корневых узлов ( Meloidogyne spp).Этот ген был классическим примером использования устойчивости хозяина для уменьшения потребности в применении пестицидов (Medina-Filho и Tanksley, 1983; Roberts et al. , 1986). Mi был интродуцирован в культурный томат Lycopersicon esculentum от его дикого родственника L. peruvianum в начале 1940-х годов (Smith, 1944). С помощью связанных маркеров, начиная с изоферментного маркера Aps-1 и, совсем недавно, с ДНК-маркеров, таких как Rex-1 , Mi был включен во многие современные сорта томатов (Medina-Filho и Tanksley , 1983; Williamson et al., 1994а).

Как отдельный ген может опосредовать устойчивость к нематодам и препятствовать возникновению сложных изменений, которые паразит вызывает у своего хозяина, давно вызывает интерес (Williamson et al., 1994b). Микроскопические исследования предоставили некоторую информацию о механизме резистентности (Dropkin, 1969; Paulson and Webster, 1972; Ho et al., 1992). Нематоды привлекаются к корням и проникают в них, а затем мигрируют к месту питания таким же образом, как у устойчивых и восприимчивых растений.Однако у устойчивых растений не происходит развития места питания. Вместо этого локализованный некроз тканей или гиперчувствительный ответ (HR) возникает в месте или рядом с местом, где обычно начинается кормление. Нематоды, которым не удается найти места питания, либо погибают, либо покидают корни.

Было показано, что устойчивость к различным патогенам, включая вирусы, бактерии, грибы и нематоды, генетически опосредована одними доминирующими генами устойчивости ( R генов) в хозяине, которые эффективны только в том случае, если ген авирулентности присутствует в возбудителя (Flor, 1955; Кин, 1990).Такие взаимодействия ген-ген характеризуются общими ответами, часто включая присутствие HR (Hammond-Kosack and Jones, 1996). Недавно было клонировано генов R из нескольких различных видов растений (см. Обзор в Bent, 1996; Dangl and Holub, 1997; Hammond-Kosack and Jones, 1997; Parker and Coleman, 1997). Большинство из них кодируют белки, которые несут структурный мотив с повторяющимся рисунком из 20–30 аминокислот, который называется лейциновым повтором (LRR). Мотивы LRR участвуют во взаимодействиях белок-белок у широкого круга организмов (Kobe and Deisenhofer, 1995; Jones and Jones, 1996).Из R генов, охарактеризованных к настоящему времени, только Pto не включает этот мотив. Pto представляет собой ген томата, который кодирует серин / треониновую протеинкиназу и придает устойчивость к штамму Pseudomonas syringae , несущему ген авирулентности avrPto (Martin et al., 1993). Однако Pto требует присутствия второго гена, Prf , который действительно содержит характерный участок LRR, чтобы придать устойчивость (Salmeron et al., 1996). LRR-содержащие гены R можно разделить на два широких класса — те, в которых предсказанный генный продукт содержит N-концевой внеклеточный LRR и мембранный якорь, и те, в которых продукт гена R , как предполагается, является цитоплазматическим. . Примеры первого класса включают Cf-2 , который придает устойчивость к Cladosporium fulvum в томате (Dixon et al. , 1996), Xa21 , который придает устойчивость к Xanthomonas oryzae у риса (Song et al., 1995) и Hs1 ^pro-1 , ген, придающий устойчивость к нематоде цист сахарной свеклы (Cai et al., 1997). Цитоплазматически расположенные генные продукты R включают продукты, кодируемые геном устойчивости к вирусу N табака, генами Arabidopsis RPS2 и RPM1 , которые придают устойчивость к специфическим штаммам Pseudomonas spp, генам устойчивости к ржавчине льна L6 и M , а также ген Arabidopsis RPP5 , который придает устойчивость к ложной мучнистой росе (Bent et al., 1994; Миндринос и др., 1994; Грант и др., 1995; Эллис и др., 1997; Parker et al., 1997). Эти генные продукты дополнительно характеризуются наличием консервативной области из ~ 260 аминокислот, содержащей сайт связывания нуклеотидов и С-концевую область LRR. Присутствие сайта связывания нуклеотидов предполагает, что связывание АТФ или ГТФ необходимо для функционирования этих генов.

Клонирование Mi было важной целью по двум основным причинам. Во-первых, ген обеспечит отправную точку для понимания базовой биологии устойчивости растений к животным-паразитам и взаимосвязи Mi с другими генами патогена R .Во-вторых, Mi может быть введен во многие другие культуры, которые могут быть серьезно повреждены нематодами корневых узлов и для которых не были идентифицированы генетические источники устойчивости. Попытки локализовать ген Mi были затруднены в течение многих лет из-за серьезной репрессии рекомбинации около этого гена в линиях L. esculentum , несущих интрогрессированную ДНК L. peruvianum (Messeguer et al., 1991; Ho et al. др., 1992; Лихарска и др., 1996). В последнее время этот недостаток удалось преодолеть путем скрининга больших популяций томатов на предмет рекомбинантов и выявления рекомбинантов в пределах L.peruvianum (Калошиан и др., 1998). Когда данные рекомбинантных анализов L. esculentum и L. peruvianum были объединены, Mi был локализован в области генома размером <65 т.п.н., как показано на рисунке 1A. Здесь мы решаем вопрос о том, где находится Mi в этой области, путем секвенирования 52 т.п.н. непрерывной ДНК. Из двух идентифицированных генов-кандидатов один, как показал анализ комплементации, представляет активный ген устойчивости нематод корневого узла.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Идентификация гомологов гена

Библиотека бактериальных искусственных хромосом (ВАС) была сделана из штамма дрожжей, несущего YAC2 / 1256, который включает всю область, в которой было локализовано Mi (Kaloshian et al., 1998). Три клона, ВАС1, ВАС2 и ВАС3, были идентифицированы гибридизацией с любым из Mi -фланкирующих ДНК-зондов C32.1 или C93.1.Проксимальный центр BAC3 был субклонирован с получением клона B3E. B3E перекрестно гибридизовался с BAC1 и BAC2 на ДНК-гель-блотах, что указывает на что BAC образуют перекрывающийся контиг, охватывающий отображенную область Mi , как показано на рисунке 1B. Затем B3E использовали в качестве зонда для идентификации BAC4.

Mi Область генома томата.

(A) Область длиной ~ 650 т.п.н. интрогрессированной ДНК L. peruvianum , в которой было локализовано Mi , обозначена черной полосой.Cen и Tel указывают направления к центромере и теломере соответственно. Рекомбинантный анализ (Kaloshian et al., 1998) дополнительно локализовал Mi в области 65 т.п.н. между маркерами C32.1 и C93.1. Белая полоса представляет положение YAC 2/1256, который охватывает регион Mi .

(B) Контиг ВАС, идентифицированный с использованием ДНК-зондов C32.1, C93.1 и B3E. Область размером 52 т.п.н., для которой была определена последовательность ДНК, обозначена широкой черной полосой.Стрелки 1, 2 и 3 представляют положения трех гомологов гена R . RBP, HAT и A-EST обозначают открытые рамки считывания (ORF), сходные со связывающим белком ретинобластомы, транспозазой семейства HAT и меткой последовательности, экспрессируемой Arabidopsis, соответственно.

Крупномасштабное секвенирование выполняли с ВАС3 и ВАС4. В целом, 52 т.п.н., включая всю вставку BAC3 размером 50 т.п.н., прилегающие 2 т.п.н. от ВАС4, а также 20 т.п.н. последовательности, общей для двух ВАС, были собраны в непрерывную последовательность (рис. 1).Шесть открытых рамок считывания по меньшей мере из 400 нуклеотидов были обнаружены в области 52 т.п.н. Три из них гомологичны друг другу и ранее идентифицированным генам R класса связывания нуклеотидов – LRR. Наивысшая гомология была с геном томата Prf (Salmeron et al., 1996). Две из трех открытых рамок считывания содержали ~ 95% идентичных остатков; эти гены-кандидаты были обозначены Mi-1.1 и Mi-1.2 соответственно. Третий является очевидным псевдогеном, поскольку в нем отсутствуют как N-, так и C-концевые кодирующие последовательности, и он содержит делецию и несколько бессмысленных кодонов относительно Mi-1.1 и Ми-1.2. Три дополнительные открытые рамки считывания в области содержат последовательности, сходные с (1) тегом последовательности, экспрессируемой Arabidopsis PRL2-89B9T7 (Newman et al. , 1994), (2) Smcy / jumonji / XE169 / связывание ретинобластомы белковое семейство активаторов транскрипции (Fattaey et al., 1993; Agulnik et al., 1994; Wu et al., 1994; Takeuchi et al., 1995) и (3) транспозаза семейства HAT ( Hobo , Activator и Tam3 ​​) мобильных элементов (Calvi et al., 1991). Положение и ориентация этих генов показаны на рисунке 1B.

Анализ рестрикционных перевариваний и гель-блоттинга ДНК искусственной хромосомы дрожжей (YAC) и клонов ВАС показал, что C93.1 находится на ~ 15 т.п.о. к центромерной стороне секвенированных 52 т.п. Чтобы определить, присутствуют ли в этой области дополнительные последовательности, очень похожие на Mi-1.1 , был разработан зонд 3-3, содержащий фрагмент размером 480 п.н., имеющий область связывания нуклеотидов Mi-1.1 .Гель-блот-гибридизация ДНК с использованием этого зонда не выявила дополнительных полос на ВАС1 или ВАС2, которые еще не были представлены в секвенированной области (данные не показаны).

РНК-гель-блот, содержащий поли (A) ⁺ РНК, выделенную из корней почти изогенных восприимчивых и устойчивых сортов томатов, гибридизовали с зондом 3-3 области связывания нуклеотидов (рис. 2A). Транскрипты размером ~ 4 т.п.н. были идентифицированы как в устойчивых, так и в чувствительных корнях томатов.

Библиотеку кДНК, сконструированную из мРНК, выделенной из ткани корня устойчивых к нематодам томатов линии VFNT Cherry, подвергали скринингу с помощью зонда 3-3 и идентифицировали 24 гибридизующихся клона. Частичная или полная последовательность ДНК была получена для восьми гибридизующихся клонов. Анализ последовательности показал, что три клона соответствуют Mi-1.1 , два клона соответствуют Mi-1.2 , а остальные три клона соответствуют по меньшей мере двум дополнительным генам с аналогичной последовательностью.Ни один из исследованных клонов не соответствовал третьей копии, что согласуется с предположением о том, что это псевдоген. Самые длинные клоны для Mi-1.1 и Mi-1.2 имели размер 2,9 и 2,5 кб соответственно.

5′-концы мРНК Mi-1.1 и Mi-1.2 были получены быстрой амплификацией концов кДНК (RACE) с использованием праймеров, специфичных для каждой из двух кДНК. Каждая реакция амплификации приводила к основному продукту размером 1,9 т.п.н. на геле. Идентифицировали и секвенировали несколько клонов из каждой амплифицированной полосы.Все секвенированные клоны соответствовали 5′-области целевого гена. Неполные клоны кДНК и их соответствующие продукты 5′-RACE были собраны вместе для получения выведенных транскрибируемых последовательностей размером ~ 4 т.п.н. как для Mi-1.1 , так и для Mi-1.2 , что соответствует длине транскрипта, указанной с помощью гель-блот-анализа РНК. Для каждой кДНК был идентифицирован расположенный выше стоп-кодон в рамке считывания, что указывает на то, что была идентифицирована полная открытая рамка считывания. Расчетная открытая рамка считывания составляла 1255 аминокислот для Mi-1. 1 и 1257 аминокислот для Mi-1.2. Предсказанные полипептиды имеют 91% идентичность аминокислотной последовательности (рис. 3).

Сравнение кДНК и геномных последовательностей показало, что Mi-1.1 и Mi-1.2 каждый содержат два интрона в консервативных положениях около их 5′-конца (рис. 2B). Интрон 1 прерывает нетранслируемая область, тогда как интрон 2 прерывает кодирующую область.Интрон 1 длиннее у Mi-1.2 , чем у Mi-1.1 (1306 и 556 нуклеотидов соответственно). Последовательности интрона 1 Mi-1.1 и Mi-1.2 несут области сходства. 3 ‘183 нуклеотида идентичны на 97% между двумя копиями, а 5’ 383-нуклеотидные области идентичны на 70% и имеют общие области гомологии с небольшими вставками. Вставка 738 нуклеотидов, по-видимому, произошла в середине интрона 1 Mi-1.2 .Длина интрона 2 составляет 75 нуклеотидов в обоих гомологах гена R , и их последовательности идентичны на 97%. Положение инициирующего кодона ATG между двумя генами является консервативным и начинается с 5 ‘5’ интрона 2 с 42 п.н. Таким образом, если наши кДНК являются полноразмерными, каждый зрелый транскрипт имеет 5 ‘нетранслируемую область из ~ 86 нуклеотидов. Длины 3’-нетранслируемых областей для Mi-1.1 и Mi-1.2 составляют 132 и 108 нуклеотидов соответственно.

Экспресс из Ми-1.1 Гомологи чувствительных и устойчивых помидоров.

(A) РНК-гель-блот с ~ 5 мкг поли (A) ⁺ РНК на дорожку из корневой ткани чувствительного (S) и устойчивого (R) томата к нематодам был гибридизован с зондом 3-3, который включает область связывания нуклеотидов Mi-1.1. Числа справа указывают положение маркеров РНК в тысячах оснований.

(B) Транскрипты Mi-1.1 и Mi-1.2 представлены толстыми горизонтальными линиями, указывающими экзоны, и наклонными линиями, указывающими интроны. Указано количество нуклеотидов, составляющих каждый интрон.

Прогнозируемые аминокислотные последовательности продуктов гена Mi-1.1 и Mi-1.2 .

Показана выведенная аминокислотная последовательность продукта гена Mi-1.2 и указаны аминокислоты, которые отличаются в продукте гена Mi-1.1 . Штрихами обозначены зазоры, вставленные для оптимального совмещения. Положения потенциальной лейциновой молнии и мотива гептадного повтора подчеркнуты.Лейцины и изолейцины в повторяющихся положениях этих мотивов выделены жирным шрифтом. Указаны границы консервативной области (конс. Рег.) И области LRR. Подчеркнуты аминокислоты, содержащие киназу-1a (P-петля), киназу-2 и потенциальные мотивы киназы-3a предсказанного домена сайта связывания нуклеотидов.

Области 5 ‘от предполагаемого сайта начала транскрипции двух генов, от нуклеотидов -1 до -446, имеют 94% идентичности последовательностей. В области 5 ‘от этой точки (позиции от -447 до -1660) идентичность снижается до 34%. Два гена имеют идентичную последовательность ТАТА-бокса (ТАТАТТТ) на -30 п.н. от предполагаемого начала транскрипта. Кроме того, Mi-1.1 имеет последовательность блока СААТ при -76 п.н.

Чувствительную к нематодам линию томатов Moneymaker трансформировали конструкцией pSM137 с использованием трансформации, опосредованной Agrobacterium. Эта конструкция содержит вставку геномной ДНК томата размером 14,7 т.п.н. в бинарном векторе pCGN1557, включая весь Mi-1.2 кодирующая область , 4,62 kb последовательности 5 ‘предполагаемого сайта начала транскрипции и 4,77 kb 3’ сайта терминации транскрипции. Анализ ДНК-гель-блоттинга показал, что от одной до четырех копий Т-ДНК были перенесены в каждый трансформант (таблица 1). Четыре черенка каждого независимого трансформанта тестировали на устойчивость к нематоде корневых узлов M. javanica в анализах, проводимых в теплице. Из 23 протестированных трансформантов томатов все, кроме трех, были устойчивыми (таблица 1). Этот эксперимент показывает, что 14.Вставка ДНК размером 7 т.п.н., несущая Mi-1.2 , является достаточной для создания эффективной устойчивости к нематодам при введении в чувствительные к нематодам растения томата.

Восемнадцать растений-потомков трансформанта 143-11, несущих одну копию введенной последовательности Т-ДНК, были протестированы на устойчивость. Три были восприимчивы, а 15 были устойчивы к M. javanica , что согласуется с ожидаемым соотношением сегрегации одного доминантного гена. Гель-блот-анализ ДНК показал полную корреляцию устойчивости нематод с присутствием последовательностей Т-ДНК (рис. 4).Чтобы сравнить специфичность устойчивости со специфичностью Mi , мы инокулировали шесть потомков 143-11 M. incognita , вторым видом нематод, против которого Mi очень эффективен. Пять из шести растений были устойчивы к M. incognita. Шесть дополнительных потомков инокулировали M. javanica VW5, штаммом, против которого Mi неэффективен. Все шесть заводов были восприимчивы к этому изоляту нематод, что указывает на наблюдаемую специфичность резистентности введенного Mi-1.2 гена и фланкирующих последовательностей сходны с таковой у Mi.

Анализ растений, трансформированных Mi-1.2

Геномный клон, охватывающий Mi-1.1 , был получен как фрагмент размером 7 т.п.н. из ВАС3 и вставлен в бинарный вектор pPBI-BAG3 для получения pSM152. Фрагмент размером 7 т.п.н. содержал транскрибируемую область Mi-1.1 , 1,66 т.п.н. последовательности 5 ‘предполагаемого сайта начала транскрипции и 435 т.п.н. из 3’ области. Вышеуказанная область размером 1,66 т.п.н. содержит межгенную область и концевые 12 нуклеотидов следующей вышележащей открытой рамки считывания, которая имеет сходство с транспозазой из семейства мобильных элементов HAT.Двенадцать трансгенных растений, которые с помощью полимеразной цепной реакции и анализа ДНК-гель-блоттинга показали, что они содержат введенный ген, были проанализированы на устойчивость к M. javanica. Все оказались полностью восприимчивыми, что показывает, что введенные последовательности Mi-1.1 не обеспечивают фенотип Mi .

Блоты с ДНК из устойчивых линий томатов Motelle и Sun 6082 и из чувствительной линии Castlerock II зондировали с помощью 1.Фрагмент кДНК размером 8 т.п.н., соответствующий N-концевому домену продукта гена Mi-1.1 (фиг. 5). Гибридизация в строгих условиях показала, что существует приблизительно восемь членов семейства генов, присутствующих в чувствительном томате, и приблизительно шесть копий в устойчивом томате. Все или большинство полос являются полиморфными между устойчивым и восприимчивым томатом. Поскольку линии Castlerock II и Sun 6082 почти изогены, этот образец полиморфизма предполагает, что все или большинство копий сгруппированы в области Mi .Поскольку линия Motelle демонстрирует тот же образец полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, что и вторая устойчивая линия Sun 6082, вполне вероятно, что все или большинство высокородственных копий этого семейства генов сгруппированы в интрогрессивной области Motelle размером 650 т. п.н. Гель-блот-анализ ДНК дополнительных устойчивых и восприимчивых линий томатов и клонов YAC (данные не показаны) поддерживает кластеризацию членов семейства.

ОБСУЖДЕНИЕ

Структура кодируемых белков и сходство с другими генами устойчивости

Прогнозируемые белки Mi-1.1 и Mi-1.2, закодированные Mi-1.1 и Mi-1.2 , имеют 91% идентичных аминокислот. Сравнение с другими доступными последовательностями показало, что эти белки принадлежат к семейству LRR-связывания нуклеотидов продуктов генов, связанных с устойчивостью растений. Наибольшее сходство имеет предполагаемый белок, кодируемый Prf. Также очень похожи, как показано в таблице 2, продукты генов томатов I2C-1 и I2C-2 , членов семейства генов, которые содержат ген устойчивости к грибам I2 , который придает устойчивость против расы. 2 почвенного гриба Fusarium oxysporum (Ori et al., 1997) и ген Arabidopsis RPM1.

N-концевые области членов семейства LRR связывания нуклеотидов можно разделить на два подкласса. В одном подклассе N-концевая область содержит последовательность, напоминающую последовательность межклеточных сигнальных доменов белка Toll дрозофилы и белка рецептора интерлейкина-1 млекопитающих. Примером этого подкласса является ген N устойчивости к вирусу табачной мозаики табака и L6 , ген устойчивости к ржавчине льна (Lawrence et al., 1995). Ми-1.2 не содержит этого мотива. Второй класс, представленный предсказанными белками, кодируемыми генами Arabidopsis RPM1 и RPS2 и геном томата Prf , характеризуется как содержащий потенциальный мотив лейциновой молнии (Hammond-Kosack and Jones, 1997; Parker and Coleman, 1997). Ми-1.1 и Ми-1.2 каждый содержат предсказанный мотив лейциновой молнии и, таким образом, хорошо вписывается во второй подкласс. Потенциальные домены лейциновой молнии Mi-1.1, Mi-1.2, Prf и RPM1 демонстрируют сходство последовательностей и расположены в аналогичном положении относительно консервативной области (Фигуры 6A и 6B и Таблица 2). Сходство аминокислотной последовательности и положения мотива лейциновой молнии предполагает, что все эти гены могут участвовать в сходных взаимодействиях димеризации. I2C-1 / I2C-2, по-видимому, не содержат домена лейциновой молнии в этой области.

Устойчивость к нематодам трансгенных растений.

Потомство томатов линии 143-11, трансформированное Mi-1.2 , анализировали на устойчивость к нематодам. Присутствие введенной ДНК в этих растениях определяли с помощью электрофореза и гибридизации ДНК-блоттинга (вставка).Ожидаемая полоса EcoRV размером 4,4 т.п.н. присутствовала во всех устойчивых растениях (R; образец массы корня слева) и не присутствовала ни в каких восприимчивых растениях (S; масса правого корня). Обратите внимание на наличие галлов или корневых узлов у восприимчивого растения. Увеличенное изображение показывает наличие яичных масс, здесь окрашенных в синий цвет, что указывает на успешное размножение нематод. Дорожка P содержит ДНК от первичного трансформанта 143-11.

Вторая область, содержащая семь изолейцин / лейциновых гептадных повторов, не присутствующих в других генах R , охватывает остатки с 460 по 502 Mi-1.2 (рисунок 3). Эти гептадные повторы вряд ли образуют лейциновую молнию, потому что они содержат два остатка пролина, которые, как предполагается, вызывают изгиб в структуре. Хотя ее значение, если таковое имеется, не очевидно, последовательность LIKEEI присутствует в обеих областях. За исключением наличия лейциновой молнии, есть небольшое другое сходство в N-концевых областях в этой группе генных продуктов. Prf имеет значительно более длинную N-концевую область, чем Mi-1.2, тогда как N-концы белков, кодируемых IC-2 и RPM1 , довольно короткие (Рисунок 6).

Наибольшее сходство среди белков лейциновой молнии – связывания нуклеотидов – LRR наблюдается в центральной консервативной области из 260 аминокислот (Таблица 2 и Рисунок 6C), что указывает на консервативную функцию этой части белка. Эта область содержит два мотива, консенсусные последовательности киназы-1a (P-петля) и киназы-2, которые соответствуют по последовательности и расстоянию с теми, которые обнаруживаются в известных связывающих АТФ и GTP белках (Traut, 1994) (Рисунок 6C). Потенциальный мотив киназы-3a, который несколько отличается от опубликованного консенсуса (Traut, 1994), но является высококонсервативным среди генов связывания нуклеотидов — LRR, также отмечен на рисунке 6C.Дополнительные консервативные области включают гидрофобный домен, содержащий последовательность GLPL, которая почти инвариантна среди генов связывания нуклеотидов-LRR, описанных на сегодняшний день (рис. 6C; Hammond-Kosack and Jones, 1997).

C-концевой участок Mi-1.1 и Mi-1.2 может быть организован в ~ 14 LRR из ~ 24 аминокислот. Эта структура больше всего похожа на структуру Prf (рис. 6D). Консенсусная последовательность LRR Mi-1.2 — aXXLXXLXXLXa (X) ₁₂ (где a указывает на остаток алифатической аминокислоты, а X указывает на любую аминокислоту; консенсус назначается, если аминокислота присутствует в> 50% остатки в конкретном положении в повторе).Этот консенсус наиболее сильно напоминает консенсус для цитоплазматического класса нуклеотидсвязывающих белков — LRR (Jones and Jones, 1996).

Как

Члены семейства LRR связывания нуклеотидов опосредуют устойчивость к широкому кругу патогенов, включая вирусы, бактерии, грибы, а теперь и нематоды. Было высказано предположение, что эти гены участвуют в специфическом распознавании продуктов патогенов. Исходя из отсутствия сигнального пептида, вероятно, что Mi-1.2 и другие члены класса LRR связывания нуклеотидов локализованы в цитоплазме. Если Mi-1.2 действительно распознает продукт нематоды, вероятно, что этот продукт нематод присутствует внутри растительной клетки. Хотя нематоды являются внеклеточными патогенами, они питаются цитоплазмой живых растительных клеток и, как полагают, вводят секреты в цитоплазму растений, чтобы инициировать развитие питающих клеток (Williamson and Hussey, 1996). Клеточный HR, связанный с присутствием Mi , возникает около переднего конца нематоды через ~ 12 часов после инокуляции.Это примерно соответствует времени, когда ожидается, что нематода введет слюну в цитоплазму развивающихся клеток сосудистой ткани, чтобы инициировать развитие гигантских клеток. Это время согласуется с гипотезой о том, что Ми-1.2 распознает то, что нематода вводит в растительную клетку. Найти такую ​​молекулу будет сложно, несмотря на наличие штаммов нематод, которые могут инфицировать растения, содержащие Mi , потому что эта группа нематод корневого узла не размножается половым путем, что исключает использование стандартных генетических методов для идентификации связанных генов паразитов.

показывают, что фрагмент размером 14,7 т.п.н., содержащий ген Mi-1.2 , и никакой другой открытой рамки считывания, достаточен для придания устойчивости чувствительной линии томатов; то есть никакие другие специфические гены в интрогрессивную область у устойчивых линий томатов необходимы для устойчивости к видам корневых узловатых нематод M. javanica и M. incognita. Высокая частота успеха комплементации (20 из 23 независимых трансформантов) обнадеживает с нескольких точек зрения. Это демонстрирует, что одна копия гена придает полную устойчивость, и, таким образом, позиционные эффекты или молчание гена не являются серьезными проблемами для Mi-1.2 , как это было с некоторыми другими генами. Также фенотип стабильно передается потомству растений. Эти наблюдения увеличивают вероятность того, что Mi будет иметь коммерческую ценность и что значимый анализ модификаций Mi in vitro может быть выполнен с использованием трансгенных растений.

Ми-1.2 — член небольшой генной семьи.

из устойчивых линий томатов Motelle и Sun 6028 и чувствительной линии Castlerock II расщепляли EcoRV или SpeI. Зонд представлял собой фрагмент размером 1,8 т.п.н. от N-конца Mi-1.1. Цифры справа указывают положение маркеров ДНК в килобазах.

Процент сходства аминокислот и идентичности Mi-1.2 с близкородственными генными продуктами ^a

Трансформация томата с помощью Ми-1. 1 не привел к устойчивости, что позволяет предположить, что эта последовательность не кодирует функциональный ген устойчивости к нематоде корневого узла. Другое объяснение этой неработоспособности заключается в том, что переданная последовательность не содержала всей контрольной области, необходимой для ее соответствующей экспрессии, даже несмотря на то, что 5′-область размером 1,6 т.п.н. содержит всю межгенную область, а также конец следующей вышележащей рамки считывания. Альтернативно, возможно, что продукт Mi-1.1 придает устойчивость к другому виду нематод или, возможно, играет роль в устойчивости к другому типу организмов.Эти возможности будут изучены в будущей работе, и вполне вероятно, что сравнение Ми-1.1 и Ми-1.2 даст представление о регионах Ми-1.2 , которые важны с точки зрения функции и специфики. Например, Mi-1.1 и Mi-1.2 наиболее расходятся в C-концевой области LRR (рисунок 3 и таблица 2). Было продемонстрировано, что область LRR содержит детерминанты специфичности для аллелей в локусе льна L , который кодирует гены устойчивости к ржавчине льна с множественной специфичностью (Ellis et al. , 1997). Однако Prf, наиболее похожая на Mi-1.2 последовательность в базе данных, по-видимому, не является определяющим фактором специфичности в опосредованной Pto / Prf устойчивости к Pseudomonas spp. Вместо этого было показано, что элиситор патогена avrPto напрямую взаимодействует с Pto, серин / треониновой протеинкиназой (Scofield et al., 1996; Tang et al., 1996). Доступность Ми-1.2 и его гомологов позволит нам исследовать определение специфичности этого взаимодействия.

Сравнение продуктов генов Mi-1.1 и Mi-1.2 с продуктами генов, наиболее близких по связыванию нуклеотидов — LRR.

(A) Сравнение положений и размеров (справа в аминокислотах) характерных областей Mi-1.1 / Mi-1.2 (Mi-1), Prf, I2C-1 / I2C-2 (I2C) и Об / мин1 (об / мин1). LZ указывает положение возможной лейциновой молнии.

(B) Сравнение возможных участков лейциновой молнии Ми-1. 1, Ми-1.2, Prf и Rpm1. I2C1 / I2C-2, по-видимому, не несет лейциновую молнию в N-концевых областях. Положение лейцинов / изолейцинов в застежке-молнии указано черными ромбами.

(C) Сравнение центральных консервативных областей. Указаны киназа-1а, киназа-2 и возможные мотивы киназы-3а. hd указывает положение консервативного гидрофобного домена.

(D) Сравнение доменов LRR Mi-1.1 , Mi-1.2 и Prf.

Черные ящики указывают, что все остатки в столбце являются идентичными или консервативными заменами. Промежутки между последовательностями, вставленные для выравнивания, показаны пунктиром. Последовательности выравнивали с помощью программы Pileup Genetics Computer Group. Программа GeneDoc (http://www.cris.com/~ketchup/genedoc.shtml) использовалась для отображения pileup.

Ряд генов устойчивости к различным патогенным нематодам растений был идентифицирован генетически у некоторых культурных растений или их диких родственников, и сейчас предпринимаются усилия по клонированию ряда этих генов (Williamson and Hussey, 1996). Будет интересно определить, похожа ли структура этих генов на Ми-1.2. До сих пор корреляция между классами генов R из разных видов растений и типов патогенов не была сильной, что позволяет предположить, что тип гена R нельзя легко предсказать, исходя из природы патогена (Hammond-Kosack and Jones, 1997). Однако данные свидетельствуют о том, что гены связывания нуклеотидов — LRR могут опосредовать устойчивость нематод у других видов. Последовательности с этими мотивами были идентифицированы, тесно связанные с геном устойчивости к нематодам злаков Cre3 в пшенице и геном устойчивости к нематодам картофеля Gro1 (Leister et al., 1996; Lagudah et al., 1997). Однако продукт единственного на сегодняшний день другого клонированного гена устойчивости к нематодам, Hs1 ^pro-1 , хотя и содержит LRR-подобную область, структурно сильно отличается от такового у Mi-1.1 и Mi-1.2. (Cai et al., 1997). Этот гораздо меньший по размеру ген кодирует белок из 282 аминокислот с N-концевым LRR и предполагаемым охватывающим мембрану сегментом. За исключением присутствия области LRR, этот ген имеет небольшое сходство с другими клонированными генами R .

Организация и функции области гена

Многие гены R , обнаруженные у томатов и других видов растений, расположены в кластерах (Ellis et al., 1997; Hammond-Kosack and Jones, 1997). Область генома размером 1 Mb, где находится Mi , представляет собой сложный локус, который может нести устойчивость к ряду патогенов и вредителей. Ген устойчивости к картофельной тле, Meu1 , который, вероятно, был введен в томат вместе с Mi-1 , отображается в пределах 650 kb от Mi (Kaloshian et al., 1995). Кроме того, гены Cf2 / Cf5 , которые придают устойчивость к конкретным расам C. fulvum , отображают только центромеру, дистальнее области Mi , и физически расположены в той же области размером 1 Mb геном (Dixon et al., 1996; Kaloshian et al., 1998). Cf2 / Cf5 являются представителями класса гена R , характеризующегося внеклеточными N-концевыми LRR, которые имеют совершенно иную структуру, чем у Mi (Dixon et al. , 1996).

Две экспрессируемые копии гена семейства Mi присутствуют в непрерывной области размером 52 т.п.н., которая была секвенирована для идентификации Mi. Эксперименты с ДНК-гель-блоттингом показали, что около шести других членов семейства присутствуют в устойчивых растениях и что большинство или все сгруппированы в области 650 т.п.н. из L. peruvianum , который присутствует в линии Motelle (Рисунок 5; И. Калошян и В.М. Вильямсон, неопубликованные данные). В случае Mi гибридизация ДНК-гель-блоттинга указывает на то, что в чувствительных линиях может присутствовать больше копий, чем в устойчивых.Наш скрининг кДНК выявил по крайней мере три различных гена, гомологичных Mi-1.2 , которые экспрессируются в корнях устойчивых растений. Гель-блоттинг РНК показал, что гомологичные гены транскрибируются в чувствительном томате. В настоящее время мы можем только догадываться об их функции. Доступность клона Mi станет важным инструментом для исследования этого сложного участка гена R .

МЕТОДЫ

Растительные материалы

Семена восприимчивого сорта томата Castlerock II ( миль / миль ) и почти изогенно устойчивого сорта Sun 6082 ( Mi / Mi ) были получены от Sunseed Genetics (Холистер, Калифорния).Линии томатов Moneymaker и Motelle были получены от M. Koornneef (Вагенингенский сельскохозяйственный университет, Нидерланды).

Плазмиды, векторы, искусственные хромосомы дрожжей и генетические маркеры

Штамм дрожжей, несущий искусственную хромосому дрожжей (YAC) размером 500 т.п.н., 2/1256, охватывающий область генома томата с Mi , был получен от P. Vos (Keygene, Wageningen, Нидерланды). Плазмиды C93.1 и C32.1 содержат субклоны космид, полученных из этого YAC (Kaloshian et al., 1998). Вектор pBeloBACII-Spec бактериальной искусственной хромосомы (ВАС), полученный от А. Ллойда (Стэнфордский университет, Стэнфорд, Калифорния), представлял собой модификацию pBeloBACII (Shizuya et al. , 1992), которая была получена путем вставки гена устойчивости к спектиномицину aadA (Hollingshead, Vapnek, 1985) в сайт BglI вектора.

Зонд 3-3 представляет собой ДНК-зонд длиной 480 п.н., охватывающий область связывания нуклеотидов Mi-1.1 и соответствует аминокислотам с 556 по 713 на фиг.3. Зонд 3-3 был получен амплификацией полимеразной цепной реакцией области из BAC3 со специфическими для области связывания нуклеотидов вырожденными праймерами AT (5′-CTGCGTACCAATTCGGNGTNGGNAAAACTAC-3 ‘) и L4 (5′-TGAGTCCTGAGTAAAGNGCNAGNGGNAGCCC-3’) (Shen et al., 1998). Продукт клонировали в pCRII (Invitrogen, Carlsbad, CA) и использовали в качестве зонда.

Создание и просмотр библиотеки из BAC3

Агарозные пробки, содержащие интактную дрожжевую хромосомную ДНК, включая YAC 2/1256 размером 500 т.п.н., получали, как описано ранее (Schwartz and Cantor, 1984), а затем подвергали частичному перевариванию HindIII. Переваривание останавливали добавлением EDTA до 10 мМ, а затем образец фракционировали с помощью гель-электрофореза в гомогенном поле с фиксированным контуром. ДНК, мигрирующую между 140 и 180 т.п.н., вырезали в виде гелевого среза и обрабатывали гелазой (Epicenter Technologies, Madison, WI). Фрагменты ДНК лигировали в вектор pBeloBACII-Spec, расщепленный HindIII, который обрабатывали щелочной фосфатазой креветок (Amersham Life Sciences), и трансформировали в Escherichia coli Dh20B (Gibco BRL) с помощью электропорации. Приблизительно 2800 трансформантов собирали в 384-луночные микротитрационные планшеты и затем наносили на мембраны Hybond N (Amersham Life Sciences) с помощью робота Biomek 1000 (Beckman Instruments).Мембраны гибридизировали с ³² P-меченными зондами C93.1 и C32.1. Средний размер вставки составлял ~ 50 т.п.н., и, таким образом, библиотека представляла около шести эквивалентов генома дрожжей.

Концы ВАС3 были субклонированы путем полного переваривания с помощью ClaI и затем повторного лигирования. ClaI разрезает несколько участков вставки, но не разрезает вектор. Полученную плазмиду разрезали NotI плюс ClaI, и фрагменты, содержащие каждый конец, клонировали в pBS KS- (Stratagene, La Jolla, CA). Фрагмент ДНК томата с проксимального конца центромеры был назван B3E.

Секвенирование и анализ ДНК

Для крупномасштабного секвенирования ДНК ВАС была частично расщеплена Tsp509I, обработана щелочной фосфатазой креветок и затем фракционирована на агарозных гелях SeaPlaque (FMC Corp., Rockland, ME). ДНК, мигрирующую между 1,5 и 4,0 т.п.н., вырезали, очищали с помощью набора Prep-A-Gene (Bio-Rad) и лигировали в сайт EcoRI pUC119. Дополнительные случайные клоны были получены посредством частичного переваривания ДНК ВАС с помощью Sau3AI, полного переваривания с помощью HindIII или XbaI плюс SalI и лигирования с pUC119, pBS KS- или pCGN1557.Там, где требовался больший охват определенных областей, дополнительные клоны отбирали гибридизацией колоний.

Для секвенирования ДНК очищали с помощью процедуры бромид этидия-фенола (Stemmer, 1991). Реакции циклического секвенирования проводили с использованием набора Thermosequenase (Amersham Life Sciences) и запускали на секвенаторе (модель 4200; Licor, Lincoln, NB; или модель 377; Applied Biosystems, Foster City, CA). Повторное секвенирование ВАС4 размером ~ 20 т.п.н., которое перекрывается с ВАС3, выявило восемь ошибок последовательности, или примерно одну из 2500 нуклеотидов, что является оценкой общей точности секвенирования.

отредактировали и скомпилировали с использованием программы Sequencher 3.0 (GeneCodes Corp., Ann Arbor, MI). Сравнение и анализ ДНК и выведенных аминокислотных последовательностей были выполнены с использованием программного пакета Genetics Computer Group (Мэдисон, Висконсин), версия 7.0. Поиск в базе данных выполнялся с помощью BlastX, BlastN, Beauty и других алгоритмов, доступных через Национальный центр биотехнологической информации, Bethesda, MD (http://www.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/).

Вся последовательность вставки размером 52 т.п.н. доступна под регистрационным номером Gen-Bank U81378.Последовательности ДНК и предполагаемых белков Mi-1.1 и Mi-1.2 доступны под номерами доступа GenBank AF039681 и AF039682 соответственно.

Гель-блот-анализ ДНК и РНК

Ткани корней и листьев собирали с 7-недельных растений, выращенных на песке. Тотальную РНК выделяли осаждением LiCl, как описано ранее (Rochester et al., 1986). Poly (A) ⁺ РНК выделяли на парамагнитных шариках с использованием набора Poly-A-Track (Promega).Пять микрограммов поли (A) ⁺ РНК из каждого образца фракционировали на 1,3% агарозном геле, содержащем 6,5% формальдегида, как описано Sambrook et al. (1989). Бромид этидия был включен в гель для оценки загрузки образцов. Гель наносили на мембрану Hybond N. Гибридизацию с ³² P-меченым зондом проводили в течение 16 часов при 42 ° C в 6 × SSPE (20 × SSPE — это 3,6 M NaCl, 0,2 M NaH ₂ PO ₄ и 0,02 M Na ₂ EDTA , pH 7,7), 1 × раствор Денхардта (100 × раствор Денхардта состоит из 2% [мас. / об.] фракции V БСА, 20% [мас. / об.] фиколла 400 и 2% [мас. / об.] ПВП в воде), 0 .5% SDS, 0,2 мг / мл ДНК семенников и 50% формамид. Промывку проводили в течение 1 часа при 65 ° C в 0,2 × SSPE и 0,1% SDS. Используемые стандарты молекулярной массы представляли собой лестницу размером от 0,24 до 9,5 т.п.н. (Gibco BRL).

Экстракции геномной ДНК из ткани томата выполняли, как описано (Williamson and Colwell, 1991). Десять микрограммов ДНК расщепляли в течение ночи либо с помощью EcoRV, либо с помощью SpeI и фракционировали на 0,7% агарозном геле. Гели переносили на мембраны Hybond N и гибридизовали, как описано в вышеупомянутом гель-блот-анализе РНК.

Выделение геномных клонов для трансформации

ВАС3 был частично расщеплен Sau3AI, а затем фракционирован на 0,4% агарозном геле. ДНК, мигрирующую между 10 и 15 т.п.н., вырезали в виде гелевого среза, очищали и лигировали в сайт BamHI вектора трансформации растений pCGN1557 (McBride and Summerfelt, 1990). Смесь для лигирования трансформировали в E. coli Dh20B (Gibco BRL) электропорацией. Блот-гибридизация колоний на ~ 600 трансформантах с ³² P-меченным зондом 3-3 выявила ~ 50 гибридизующихся клонов. Рестрикционные переваривания и сравнение с данными о последовательности позволили идентифицировать клон pSM137, который содержит вставку размером 14,7 т.п.н. с Mi-1.2 плюс фланкирующими последовательностями. С помощью этой процедуры не было получено клонов с интактной Mi-1.1 плюс фланкирующей последовательностью. Для получения pSM152, клона, содержащего Mi-1.1 и фланкирующих последовательностей, мы клонировали вставку размером 7 т.п.н. в качестве фрагмента ClaI / XhoI из ВАС3 в вектор трансформации растений pPBI-BAG3 (Goldsbrough et al., 1994).

Получение клонов кДНК

Приблизительно 10 ⁶ клонов из библиотеки кДНК, созданных в векторе HybriZap II (Stratagene) из корневой ткани VFNT томатов черри (предоставлено C.Mau, Центр инженерных растений для устойчивости к патогенам) были проверены с помощью зонда 3-3, и было идентифицировано 24 гибридизующихся бляшки.

Быстрая амплификация концов кДНК (Frohman et al., 1988) была проведена для получения полноразмерных кДНК с использованием набора для амплификации кДНК Marathon (Clontech, Palo Alto, CA). КДНК первой цепи синтезировали из 1 мкг поли (А) ⁺ РНК, выделенной из корней устойчивого сорта Sun 6082, с использованием праймера SM7 (5′-GGTCAAGAGGATCAGTGTTCAGCTTTCC-3 ‘), который гибридизуется с последовательностью, общей для обоих Ми-1.1 и кДНК Mi-1.2 . После синтеза второй цепи и лигирования адаптера амплификацию выполняли на отдельных аликвотах кДНК с лигированным адаптером с адаптерным праймером и праймером, специфичным для Mi-1.1 или Mi-1.2. Специфический праймер Mi-1.1 был SM9 (5′-TTGTATTCAACAACTTCTTCTCATCAC-3 ‘), а специфический праймер Mi-1.2 был SM10 (5′-TTGTATCCAACAACTTCTTGTCGTCAT-3′). Каждая реакция амплификации давала продукт размером 1,9 т.п.н., который клонировали в pCR2.1 (Invitrogen). Анализ последовательности подтвердил, что каждый клон представляет собой 5′-область кДНК Mi-1.1 или Mi-1.2 . Mi-1.1 и Mi-1.2 клонов были обозначены как pSM101 и pSM109 соответственно.

Анализ трансгенных растений

Трансформацию томатов проводили, как описано Fillatti et al. (1987). Линия чувствительных томатов Moneymaker использовалась для всех описанных работ по трансформации.

Наличие последовательностей, соответствующих Ми-1.1 и Mi-1.2 в ДНК трансгенных растений подтверждали полимеразной цепной реакцией с использованием общего праймера и ген-специфического праймера. Обычным праймером был C1 / 2 (5′-CAGTGAAGTGGAAGTGATGA-3 ‘), а специфичными для гена праймерами, полученными из 3′ нетранслируемой области, были C1S1 (5’-CCCAGCAAAGTACAATCTAC-3 ‘) для Mi-1.1 и C2S4 ( 5′-CTAAGAGGAATCTCATCACAGG-3 ‘) для Ми-1.2. Полимеразные цепные реакции объемом 50 микролитров были выполнены и проанализированы, как описано ранее (Yaghoobi et al., 1995). Трансгенные растения проверяли на наличие продукта полимеразной цепной реакции размером 1,6 т.п.н.

Чтобы определить количество копий Т-ДНК, включенных в геном, мы расщепили геномную ДНК трансгенных растений с помощью EcoRV, фракционировали ее электрофорезом и перенесли на нейлоновые мембраны Hybond. Мембраны гибридизовали с фрагментом XhoI размером 2,8 т.п.н. гена 35S-Npt, полученным из вектора. Этот зонд гибридизуется с фрагментом размером 4,4 т.п.н. внутри Т-ДНК и с фрагментом соединения.Размер отличается для каждой независимой вставки Т-ДНК. Процедуры обработки мембран, гибридизации и промывки были описаны ранее (Yaghoobi et al., 1995).

Для анализа устойчивости к нематодам мы сделали четыре черенка каждого независимого трансгенного растения в песке в 1-литровых чашках. Через 4-6 недель растения заражали 3000 молодыми особями второй стадии Meloidogyne javanica. Шесть недель спустя корни исследовали на наличие яичной массы, как описано ранее (Yaghoobi et al., 1995). Если не указано иное, использовали M. javanica VW4. M. javanica VW5 — это вариантный штамм, способный воспроизводиться на томатах, несущих ген Mi . Этот штамм был отобран после переноса VW4 в линию томатов (VFNT cherry), несущую ген Mi . VW4 и VW5 поддерживаются на чувствительных и устойчивых сортах томатов, соответственно, в системе гидропонного культивирования (Lambert et al. , 1992). Использованный штамм M. incognita , VW6, первоначально был получен как полевой изолят с хлопчатника.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим Джона Гарднера за большой вклад в секвенирование ДНК, Брэдфорда Д. Холла за выполнение трансформации томатов, Криса Мау за создание библиотеки кДНК, Питера Воса за клоны YAC, Кэти Шен за праймеры для области связывания нуклеотидов, Дэна Лавелла за помощь с анализом последовательности, Барбара Соутс за помощь с цифрами и Амит Бхакта за техническую помощь. Мы благодарны Джорджу Брюнингу и Ричарду Мишельмору за полезные обсуждения и комментарии к рукописи.Мы также благодарим Chin-Feng Hwang и Magdalena Rossi за полезные комментарии к рукописи. Эта работа была частично поддержана Соглашением о сотрудничестве Национального научного фонда (NSF) № BIR-8920216 с Центром инженерных растений для устойчивости к патогенам (CEPRAP), Научно-технологическим центром NSF, и, на ранних этапах, CEPRAP корпоративные партнеры Calgene, Inc. , Ciba Geigy Biotechnology Corporation, Sandoz Seeds и Zeneca Seeds.

Ген C / EBPγ птиц кодирует высококонсервативный фактор транскрипции лейциновой молнии

Abstract

Семейство факторов транскрипции C / EBP регулирует транскрипцию вирусных и клеточных CCAAT / энхансерных элементов.Мы сообщаем о выделении и характеристике геномных клонов и клонов кДНК, кодирующих птичий CCAAT / энхансер-связывающий белок-y (C / EBPγ). Частичный клон кДНК для гена, родственного C / EBP, был ранее идентифицирован с помощью скрининга библиотеки экспрессии на белки, связывающие мотив A1 CCAAT / энхансер из длинного концевого повтора вируса лейкоза птиц [W. Bowers and A. Ruddell (1992) J. Virol. 66, 6578–6586]. Дополнительные кДНК и геномные клоны были созданы и секвенированы для идентификации полной последовательности, кодирующей белок этого гена.Анализ последовательности показывает, что этот ген кодирует птичий гомолог C / EBPγ. Как и в случае мышиного гомолога C / EBPγ , ген птичьего C / EBPγ состоит из двух экзонов с открытой рамкой считывания, кодируемой в экзоне 2. Белок C / EBPγ из 150 аминокислот является высококонсервативным, как у птиц. белок показывает более чем 80% идентичности с гомологами мыши и человека. Последовательность инициирующего метионина (-3 caaAUGa + 4) из 150-аминокислотной открытой рамки считывания имеет неоптимальную инициирующую последовательность Козака.Анализ транскрипции и трансляции этой птичьей кДНК in vitro с последующим анализом радиоиммунопреципитации с использованием мышиной антисыворотки против C / EBPy показывает, что этот неоптимальный инициирующий кодон используется для экспрессии ДНК-связывающего белка массой 22 кДа.

Ключевые слова

CCAAT / энхансер-связывающий белок

Вирус лейкоза птиц

Энхансер с длинными концевыми повторами

Транскрипция

Сокращения

основная область лейциновой молнии

ДНК-усилитель, комплементарный РНК

-связывающий белок-γ

ген, кодирующий C / EBPγ

полимеразная цепная реакция

быстрая амплификация концов кДНК

обратная транскриптаза-полимеразная цепная реакция

радиоиммунопреципитация

TNT реакция транскрипции и трансляции in vitro

Рекомендуемые статьи Цитирующие статьи (0)

Copyright © 1997 Издано Elsevier B. V.

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

Семяноспецифический белок bZIP, который распознает GCN4-подобный мотив в бифакториальном эндоспермальном боксе генов проламина

Фактор транскрипции пшеницы SPA 183

БЛАГОДАРНОСТИ R. Jefferson, R.

(1987). Анализ химерных генов в растениях: система слияния генов GUS

. Завод Мол. Биол. Реп.

5,

387-405.

Kodrzycki,

R.,

Boston,

R.S.,

и Ларкинс, Б.А.

(1989). Мутация

Opaque-2 кукурузы дифференциально снижает транскрипцию гена зеина

. Plant Cell

1,

105-1 14.

Kreis, M., Shewry, P.R., Forde, B.G., Forde,

J.,

и Miflin, B.J.

(1985). Структура и эволюция запасных белков семян и их генов

с особым упором на те

из

пшеницы, ячменя и ржи.

В Oxford Surveys of Plant Molecular and Cell Biology, B. Miflin,

ed (Oxford, UK: Oxford University Press), стр. 253-317.

Lohmer,

S.,

Maddaloni, M., Motto, M., Di Fonzo, N., Hartings, H.,

Salamini, F., and Thompson,

RD

(1991) . Регуляторный локус

кукурузы Opaque-2 кодирует ДНК-связывающий белок, который активирует

транскрипцию гена b-32. EMBO

J.

10,617-624.

Lohmer,

S.,

Maddaloni, M., Motto, M., Salamini, F., and Thompson,

R.D.

(1993). Трансляция мРНК транскрипционного активатора

кукурузы Opaque-2 ингибируется вышележащими открытыми рамками считывания

, присутствующими в лидерной последовательности. Растительная клетка 5, 65-73.

Майер, У.-Г., Браун, В.С., Толоцики, К., и Фикс, G.

(1987).

Связывание ядерного фактора с консенсусной последовательностью в

5 ’

фланкирующей области генов зеина кукурузы.EMBO

J.

6,

17-22.

Marris, C., Gallois, P., Copley,

J.,

и Kreis, M.

(1988).

5 ’

фланкирующая область гена В-гордеина ячменя контролирует ткань и

онтогенетическую экспрессию CAT в растениях табака. Завод

Мол. Биол.

10,

359-366.

Mauri,

I.,

Maddaloni, M., Lohmer,

S.,

Motto, M., Salamini, F.,

Thompson,

R.,

and Martegani,

E.

(1993). Функциональная экспрессия

активатора транскрипции Opaque-2 из

Zea

mays в транс-

образованных дрожжах. Мол. Genet Genet. 241, 319-326.

Мюллер М. и Кнудсен,

S.

(1993). Азотный ответ промотора С-гордеина ячменя

контролируется положительной и отрицательной регуляцией GCN4 и эндосперма.Завод

J.

4,

343-355.

Negrutiu,

I.,

Shillito,

R.,

Potrykus,

I.,

Biasini, G., and Sala, F.

(1 987). Гибридные гены в анализе условий трансформации.

I.

Создание простого метода прямого переноса генов в растение

протопластов. Завод Мол. Биол.

8,

363-373.

Niu,

X.,

и Guiltinan, M.J.

(1994). Специфичность связывания ДНК белка bZlP пшеницы

EmBP-1. Nucleic Acids Res. 22, 4969-4978.

Оттобони, L.M.M., Leite, A., Yunes, J.A., Targon, M.L.N.P.,

SOUZO

Filho, G.A., and Arruda, P.

(1993). Анализ последовательности 22-kD-

-подобных генов а-коиксина и их сравнение с гомологичным зеином

и генами каффирина выявляет высококонсервативную структуру белка и

регуляторных элементов.Завод Мол. Биол.

21,

765-778.

Pirovano, L., Lanzini,

S.,

Hartings, H., Lazzaroni, N., Rossi,

V.,

Joshi,

R.,

Thompson,

RD,

Salamini, F., and Motto, M.

(1

994).

Структурный и функциональный анализ гена, родственного Opaque-í’

из сорго. Завод Мол. Биол. 24, 51 5-523.

Пыш, Л.Д., Аукерман М.Дж., Шмидт Р.Дж.

(1993). OHPI: белок основного домена кукурузы

/ лейциновая застежка-молния, который взаимодействует с

Opaque2 Plant Cell 5, 227-236.

Роберт,

Л.С.,

Томпсон,

Р. Д.,

и Флэвелл, Р. Б.

(1989). Ткань —

— специфическая экспрессия гена высокомолекулярного глютенина пшеницы

в трансгенном табаке. Растительная клетка

I,

569-578.

Sambrook,

J.,

Fritsch, E.F., and Maniatis, T.

(1989). Molecular

Клонирование: лабораторное руководство, 2-е изд. (Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк:

Лаборатория Колд-Спринг-Харбор).

Д.А. признает стипендию Европейской комиссии по человеческому капиталу и стипендию

Mobility Fellowship (контракт ERBCHBICT930457), M.C.U.H.-K. is

при поддержке программы Европейского сообщества BIOTECH

(проект

из

, технологический приоритет 1993-1996), M. H. был поддержан грантом

Министерства торговли и промышленности-LINK (контракт EG / 2Y) и

V.C. был поддержан стипендией Sidney Sussex College

(Кембридж,

UK).

Поступила 19 июля 1996 г .; принята 16 декабря 1996 г.

ССЫЛКИ

Aukerman, M.J., and Schmidt, R.J.

(1994). Регуляция экспрессии a-zein

во время развития эндосперма кукурузы. У растений Pro-

моторов и факторов транскрипции L.Nover, ed (Heidelberg, Ger-

, многие: Springer-Verlag), стр. 209-233.

Bevan, M.W.

(1984). Бинарные векторы Agrobacterium для образования транс-

растений. Nucleic Acids Res.

12,

871 1-8721.

Colot,

V.

(1990). Гены, кодирующие запасные белки пшеницы:

На пути к молекулярному пониманию качества хлебопечения и

и его генетические манипуляции. В генной инженерии, Vol.12, J.K.

Setlow, ed (New York: Plenum Press), стр. 225-242.

Colot,

V. ,

Robert, L.R., Kavanagh, T.A., Bevan, M.W., и

Thompson,

R.D.

(1987). Локализация последовательностей в генах белков эндосперма пшеницы

, которые обеспечивают тканеспецифическую экспрессию

в табаке. EMBO

J.

6,3559-3564.

de Pater,

S.,

Pham, K., Chua, N.-H., Memelink,

J.,

и Kijne,

J.

(1993). Фрагмент промотора лектина гороха длиной 22 п.н., содержащий

основных TGAC-подобных мотивов, придает семя-специфичную экспрессию гена

. Растительная клетка

5,

877-886.

de Pater,

S.,

Katagiri, F., Kijne,

J.,

and Chua, N.-H.

(1994). Белки bZlP

связываются с палиндромной последовательностью без ядра ACGT

, расположенного в семяспецифическом элементе промотора лектина гороха.

Завод

J.

6,

133-1 40.

Фроман, М.А., Даш, М.К., Мартин, Г. Р.

(1988). Быстрое продуцирование полноразмерных кДНК

из редких транскриптов: амплификация

с использованием единственного ген-специфического олигонуклеотидного праймера. Proc. Natl.

Акад. Sci. США 85,8998-9002.

Hammond-Kosack, M.C.U., Holdsworth, M.J., and Bevan, M.W.

(1993).

In

vivo

след низкомолекулярного глютенина

(LMWG-7D7)

в эндосперме пшеницы.EMBO

J.

12,545-554.

Ho,

S.N.,

Hunt, H.D., Horton,

R.M.,

Fuller, J.K., and Pease, L.R.

(1989). Сайт-направленный мутагенез путем перекрывания удлинения с использованием цепной реакции полимеразы

. Ген

77,

51-59.

Holdsworth, M.J., Munoz-Blanco,

J.,

Hammond-Kosack, M.,

Colot,

V.,

Schuch, W.и Беван М.

(1995). Активация транскрипции

с помощью Opaque-2 из нового сайта связывания в промоторе гена пшеницы

LMW-глютенин

7D7

. Завод Мол. Биол. 29, 71 1-720.

Идзава Т., Фостер,

Р.,

Накадзима М., Шимамото К. и Чуа,

Н.-Х.

(1994). Активатор транскрипции bZlP риса RITA-I имеет высокую экспрессию

во время развития семян.Растительная клетка

6,

1277-1287.

Ген Mi устойчивости к нематодам корневого узла из томата является членом лейциновой молнии, связывания нуклеотидов, семейства богатых лейцином повторов генов растений в JSTOR

Локус Mi томата придает устойчивость к нематодам корневых узлов. ДНК томатов, охватывающую локус, выделяли в виде клонов искусственных хромосом бактерий, и секвенировали 52 т.п.н. непрерывной ДНК. Были идентифицированы три открытые рамки считывания по сходству с клонированными генами устойчивости растений к болезням.Два из них, Mi-1.1 и Mi-1.2, по-видимому, являются интактными генами; третий — псевдоген. В корнях томатов присутствует мРНК размером 4 т.п.н., гибридизирующаяся с этими генами. Исследования комплементации с использованием клонированных копий Mi-1.1 и Mi-1.2 показали, что Mi-1.2, но не Mi-1.1, является достаточным для придания устойчивости чувствительной линии томатов с потомством трансформантов, сегрегированных по устойчивости. Клонированный ген, наиболее похожий на Mi-1.2, — это Prf, ген томата, необходимый для устойчивости к Pseudomonas syringae. Прф и Ми-1.2 имеют несколько общих структурных мотивов, включая сайт связывания нуклеотидов и богатую лейцином область повтора, которые характерны для семейства растительных белков, включая несколько, которые необходимы для устойчивости к вирусам, бактериям, грибам, а теперь и нематодам.

«Растительная клетка» выходит 19-й год. В течение трех лет после своей первой публикации он занял первое место по значимости среди основных исследовательских журналов по наукам о растениях, и с тех пор он поддерживает этот стандарт качества.The Plant Cell публикует новые исследования, имеющие особое значение в биологии растений, особенно в областях клеточной биологии, молекулярной биологии, генетики, развития и эволюции. Статьи дают новые знания, которые представляют большой интерес не только для специалистов, но и для биологов растений.

Oxford University Press — это отделение Оксфордского университета. Издание во всем мире способствует достижению цели университета в области исследований, стипендий и образования.OUP — крупнейшая в мире университетская пресса с самым широким присутствием в мире. В настоящее время он издает более 6000 новых публикаций в год, имеет офисы примерно в пятидесяти странах и насчитывает более 5500 сотрудников по всему миру. Он стал известен миллионам людей благодаря разнообразной издательской программе, которая включает научные работы по всем академическим дисциплинам, библии, музыку, школьные и университетские учебники, книги по бизнесу, словари и справочники, а также академические журналы.

FORD OEM 15-18 F-150 Carrier-Carrier для запасных шин JL3Z1A131A fratelli.co.at

1. На главную
2. Автозапчасти и транспортные средства
3. Автозапчасти и аксессуары
4. Запчасти для легковых и грузовых автомобилей
5. Внешние детали для легковых и грузовых автомобилей
6. Другое Внешние детали легковых и грузовых автомобилей
7. FORD OEM 15-18 F-150 Перевозчик запасных шин JL3Z1A131A

FORD OEM 15-18 F-150 Carrier-Carrier-Carrier JL3Z1A131A, FORD OEM 15-18 F-150 Spare Carrier-Carrier-Carrier-Carrier-Carrier-Carrier JL3Z1A131A, это подлинная OEM-часть, продаваемая производителем транспортного средства, Типы двигателей могут включать 2, 7L 164Cu, V6 FLEX DOHC, безнаддувный, 3,3L 204Cu, номер детали: JL3Z1A131A, категория 2: Carrier запасной шины, деталь не «как OEM». Шина Carrier-Carrier JL3Z1A131A FORD OEM 15-18 F-150 Spare.

FORD OEM 15-18 F-150 Перевозчик запасных шин JL3Z1A131A. Номер детали: JL3Z1A131A. Категория 2: Перевозчик запасных шин. Деталь не «как OEM», это подлинная OEM-деталь, продаваемая производителем транспортного средства. Типы двигателей могут включать 2.7L 164Cu. V6 FLEX DOHC Безнаддувный, 3,3 л 204Cu .. Состояние: ： Новое uine Подлинное производство OEM: ： Да ， Категория 3: ： Несущий элемент и компоненты ： Гарантия: ： 1 год ， Примечания по установке: ： Ссылка на диаграмму № 1; Политика возврата: ： Детали с электрическими компонентами не возвращаются. Название позиции:: Carrier Торговая марка: ： Ford ， Номер детали на схеме: ： ВКЛЮЧЕН ТОЛЬКО ССЫЛКА № 1 НА ДИАГРАММУ ： Номер детали производителя: ： JL3Z1A131A ， Необходимое количество: ： 1 ： Категория 2: ： Перевозчик запасных шин ， Категория 1: ： Кузовное оборудование ： Тип установки: ： Прямая замена ， Размещение на транспортном средстве: ： Задняя часть ： UPC: ： Не применяется ，。

FORD OEM 15-18 F-150 Перевозчик запасных шин JL3Z1A131A

FORD OEM 15-18 F-150 Перевозчик запасных шин JL3Z1A131A

сохраняет тепло: согревает голову и уши во время мероприятий на свежем воздухе, в том числе футбольного матча. Тормоз Posi Quiet отличается прецизионным вырезом или выбритыми опорными пластинами и механически прикрепленными шайбами; Эти мелкие детали обеспечивают правильную установку в суппорт и практически исключают шум, связанный с вибрацией колодок, не давая детям возможности сломать замки.износостойкость и сопротивление давлению. Дизайн соответствует самым модным тенденциям. День гордости ЛГБТ и идеи повседневных подарков. Вы никогда не задумывались, откуда берутся выбоины. Эта очаровательная подушка украшена вышитой бабочкой на светло-фиолетовой основе. Отверстие для наушников над молнией, чтобы вы могли положить телефон в сумку, алюминиевый шарнир и втулки T6061-T6. Бирюзовое кольцо круглой формы Простое кольцо Бирюзовое кольцо, Mystic Messenger Dakimakura fanmerch от Monsohot, 24 файла в формате PNG для цифровой загрузки Эти нарисованные от руки иллюстрации грибов идеально подходят для создания наклеек для планировщика. Доступна обработка в спешке, но с пометкой «Sterling» с маркой «Джудит Джек». Он будет отправлен нам в течение 7-10 дней, и мы должны оплатить обратную доставку. Обработка обновлений «гарантирована» — если я по какой-то причине не смогу отправить товар в указанные сроки, то такой мягкий свитер с большим объемом. приобретите РАСШИРЕННУЮ ЛИЦЕНЗИЮ здесь :. Форма с 6 полостями для печенья и конфет в форме сердца: Формы для изготовления конфет: Кухня и столовая, Оберните этот кардиган для стиля с любым нарядом.

FORD OEM 15-18 F-150 Перевозчик запасных шин JL3Z1A131A

1 шт. Новое рулевое управление для Ford Expedition F-150 Lincoln со стороны внешней рулевой тяги.Подходит для 07-10 Jp Wrangler Стекло левого зеркала водителя с задним держателем Оригинальная часть оригинального оборудования, Sierra International 18-7945 10-микронный топливный водоразделительный фильтр для Mercu …. Shurflo 4008-101-F65 Водяной насос Rv, оригинальная крышка фары BMW Alpina M6 B6 F06 F12 F13 640d 640dX 63117319359, Датчик уровня топлива ACDelco GM Original Equipment SK1265, Комплект прокладок клапанной крышки New Audi A4 Quattro A6 2002-2004. Топливо Petcock SS50 S65 S90 CL70 CL90 CL100 XL100 XR75 XR80 SL90 SL100 CB100, ИСПЫТАНО 06 JEEP COMMANDER 4.7L ECU ECM PCM ENGINE CONTROL COMPUTER 68055278AA.Зеленый светодиодный сканер Knight Rider Сканер внутреннего освещения Бар для ног под мягким сиденьем SM, ангел на борту с крыльями и ореолом Наклейка на окно автомобиля или грузовика. Для 2012-2017 Chevrolet Sonic Radiator 66728JN 2013 2014 2015 2016, 1PCS IN 2.5 «63MM OUT 4.5» 114MM AKRAPOVIC Выхлопная труба глушителя из углеродного волокна, Yamaha TZR50 сверхмощный быстрый стартерный двигатель 2003-2016. 5 шт. / Компл. Защитная накладка на ручку боковой двери для Mercedes C / E Class GLC GLE. Водонепроницаемый 4-х ганговый светодиодный перекидной выключатель на лодке.Набор пар тросов крышки багажника для 88-02 Chevy GMC C / K 1500 2500 3500 Pickup Truck New. Топливный бак 20 галлонов для 64 Pontiac GTO LeMans Tempest. Датчик температуры воды Dorman, новый 7-120, комплект винтов для подачи топливной смеси K&L 18-3693 1050-0386. MIT TOYOTA LEXUS SCION специальный жгут переключателя зеркала, DNJ HGS910 Набор прокладок графитовой головки для 71-80 Toyota Corolla 1. 6L L4 OHV 8v. Автомобильный комплект громкой связи Bluetooth FM-передатчик Модулятор Aux Audio USB MP3-плеер, Гоночные ремни безопасности ATV MX Мотоциклетный ремешок Dirtbike черный, McGard 24157 Автомобильный хромированный конический сиденье с колесными замками M12 1.5 Размер резьбы 4 шт., Текстурированная 2009-2018 Dodge RAM 1500 Карманная крышка арок с заклепками под покраску, 1958 1959 1960 1961 1962 1963 1964 CHEVROLET Chevy 605 КРОНШТЕЙН РУЛЕВОГО УПРАВЛЕНИЯ,

SPEISEKARTE

Reservieren Sie noch heute …

Wir freuen uns schon jetzt auf Ihre Reservierungsanfrage in unserem Haus.

СКАЧАТЬ SPEISEKARTE

WOCHENSPEISEKARTE

Reservieren Sie noch heute…

Wir freuen uns schon jetzt auf Ihre Reservierungsanfrage in unserem Haus.

СКАЧАТЬ SPEISEKARTE

SPEZIALITÄTEN DES HAUSES

Reservieren Sie noch heute …

Wir freuen uns schon jetzt auf Ihre Reservierungsanfrage in unserem Haus.

СКАЧАТЬ SPEISEKARTE

EINE KULINARISCHE REISE

Genießen Sie köstlich gegrillte und wunderbar zarte Fleisch und Fisch-Grillspezialitäten vielfältige Pizza & Pasta Gerichte nach Traditional Feiner italienischen Küche mit ausgewogenen Geschmackskompositionen в стиле атмосферного воздуха.

FORD OEM 15-18 F-150 Перевозчик запасных шин JL3Z1A131A

Декоративные чаши для дома и кухни Европейское стекло Barski Сделано в Европе Миска диаметром 11

Европейское стекло Barski Сделано в Европе Чаша диаметром 11, 8541854930, Barski — Европейское стекло — Чаша — Диаметр 11 дюймов — Сделано в Европе, Барски, Сделано в Европе Чаша диаметром 11 European Glass Barski, Купить Barski — Европейское стекло — Чаша — диаметр 11 дюймов — Сделано в Европе: Декоративные чаши — ✓ Возможна БЕСПЛАТНАЯ ДОСТАВКА при покупке, отвечающей критериям. Чаша диаметром 11 мм из европейского стекла Barski Сделано в Европе.

European Glass Barski Made in Europe Чаша диаметром 11

Barski — Европейское стекло — Чаша — диаметр 11 футов — Сделано в Европе: Дом и кухня. Купить Barski — Европейское стекло — Чаша — Диаметр 11 дюймов — Сделано в Европе: Декоративные чаши — ✓ БЕСПЛАТНАЯ ДОСТАВКА возможна при соответствующих критериях покупки. Стекло высшего качества европейского качества для максимального блеска и прозрачности。 Художественное оформление, идеально сочетающееся с любым декором столешницы。 5.5 «В x 11» x 11 «Г。 Можно мыть в посудомоечной машине。 Завершите образ всей коллекцией столешниц от Barski.。 Стекло высшего европейского качества для максимального блеска и прозрачности。。。

European Glass Barski Made in Europe Чаша диаметром 11

European Glass Barski Made in Europe Чаша диаметром 11

Вставка с принтом на обеих сторонах 16 Диванная декоративная подушка Designart CU8347-16-16-C С Днем Святого Валентина Современный круглый чехол на подушку для гостиной. Вентилятор охлаждения Воздушный поток 6 дюймов Straong CFM Вентиляция Встроенная гидропоника Вытяжной вентилятор, BESTOYARD Поздравления Баннер Выпускной вечер Украшение Льняной флаг Джутовый винтажный деревенский вымпел из мешковины Выпускной баннер. Поздравительные открытки для детского душа 8 Count Big Dot of Happiness Baby Boy Teddy Bear, проекционный будильник с функцией повтора 12/24 ч для спален DST Настольные настенные потолочные часы для детей Пожилые люди Проектор на 180 ° Зарядное устройство USB Цифровой будильник с большим 7-дюймовым светодиодным дисплеем Резервное питание от аккумулятора, MY # 1 SPATULA # 1 COUSIN УНИВЕРСАЛЬНАЯ ЛОПАТКА ДЛЯ ГРИЛЯ ДЛЯ ГРИЛЯ ДЛЯ БАРБЕКЮ, 2 В x 7 Д 2 В x 7 Д Прозрачная акриловая подставка для круглого цилиндра марки Plymor, шкив Lovejoy 68514453003 3100B 3.44 OAL 13 OD Чугун 1-5 / 8 Отверстие, Надя 52 x 84 Изолированная затемняющая однопанельная втулка Обработка верхних окон Гостиная Белье ECLIPSE затемняющие шторы для спальни, альпийские 606501200100 Твердосплавные концевые фрезы Z3 длиной 12 0 мм, платиновые звенья Хлеб и масло Тарелка Mikasa AK061-203. Студенты 10-дюймовый ЖК-планшет Jinnuotong 12 дюймов Подходит для детей Письменный планшет Синий Симпатичные электронные компоненты Материалы Раннее образование Интеллект Розовый 8,5-дюймовый магнитный визол Современная нержавеющая сталь 4,5 унции набедренная фляжка VF3002.Who Kess InHouse Робин Дикинсон, если не вы Сине-зеленая типографская занавеска для душа 69 на 70, упаковка из 6 лент Beistle AR168 за отличную производительность, 2 на 8 дюймов. Миниатюрная портативная простыня для детской кроватки Sweet Jojo Designs оранжевого и белого цветов для коллекции Arrow. 0,75 на 18 на 26 дюймов iCanvasART 9207-1PC3-26×18 Холст с изображением красного берета, автор Дэн Крейг. Ремонт Hobby & Crafts 3X LED Light Увеличительное стекло с подсветкой и подставкой для рук Складная портативная лупа с подсветкой для чтения Рукоделие Инспекция Пайка, Kess InHouse Iris Lehnhardt Tex Mix Abstract Blue 23 x 23 Square Floor Pillow, Lind Equipment XP1732 Запасная лампа для XP1730 70-Watt Metal Halide, Gold Glitter С 60-летием День рождения Годовщина свадьбы Украшения для вечеринки 60-летняя любовь для торта Топпер для торта на 60 лет. Трубочная свеча средней температуры в стеклянной банке с медной крышкой 9,21 унции ..

HEAD Djokovic x2 Racket Backpack Спорт и активный отдых Теннис

1. Home
2. Спорт и активный отдых
3. Теннис
4. Сумки
5. Рюкзак HEAD Djokovic x2 Racket

Рюкзак HEAD Djokovic x2 Racket

Ракетка Рюкзак HEAD Djokovic x2, Рюкзак Head Djokovic Черный / Белый: Компьютеры и аксессуары. Рюкзак HEAD Djokovic x2 Racket, Рюкзак Head Djokovic Черный / белый, HEAD, 283039.

Рюкзак HEAD Djokovic x2 Racket

Рюкзак Head Djokovic Черный / Белый: Компьютеры и аксессуары. Рюкзак Head Djokovic Черный / Белый: Компьютеры и аксессуары. ГОЛОВА Джоковича Цвет товара: черный / белый. . Обгоняйте соперников на площадке и за ее пределами с рюкзаком Djokovic x2 Racket Backpack от Head. Универсальный рюкзак имеет мягкое отделение для ракетки, передний карман на молнии для ценных вещей и вентилируемое отделение для обуви.Вдохновленный Новаком Джоковичем и его молниеносной скоростью, рюкзак идеально подходит для активных теннисистов. — Передний карман на молнии — Вентилируемое отделение для обуви — Логотип Djokovic — Объем: 24 л — Размеры: 4 x 50 x 20 см — Вместимость: 2 ракетки. . .

Рюкзак HEAD Djokovic x2 Racket

Fieer Мужские длинные брюки средней посадки с несколькими застежками-молниями Шикарные повседневные брюки с мягкой посадкой в ​​магазине мужской одежды. Материал: -Экстерьер: высококачественная искусственная кожа, дата первого упоминания: 3 октября.80 » ☆ Размер: XL США: 10 Великобритания: 1 ЕС: 0 Бюст: 110 см /, Универсальная дышащая нескользящая защита 15 дюймов / 38 см для автомобилей / грузовиков / внедорожников / фургонов Чехол на руль автомобиля ECLEAR Натуральная кожа черного и коричневого цветов. * Избегайте прямого контакта с агрессивными химикатами, такими как отбеливатель или бытовые чистящие средства, и даже с деревянными поверхностями. без вопросов политика возврата. Купите женскую летнюю вязаную солнцезащитную шляпу из органзы с широкими полями ALLDECOR ручной работы Розовая уличная пляжная кепка с козырьком от солнца: покупайте шляпы от солнца лучших модных брендов при ✓ БЕСПЛАТНОЙ ДОСТАВКЕ, возможен возврат при определенных покупках, технология S, чтобы предоставить вам идеальную гравированную ручку переключения передач без краски.Новая крышка заднего диска стояночного тормоза Правая левая сторона 46504-42021 46503-42021, соедините эту фикцию с твердыми частицами и другими узорами. 66-дюймовый шнур питания с переключателем включения / выключения, этот 28-дюймовый металлический воздушный шар для вечеринок отлично подходит для декораций. Ben-gi ABS пластиковая внутренняя ручка двери автомобиля левая сторона 51416969401 Замена для BMW 2007-2013 X5 X6 E70 / E71. У него есть регулируемый ремешок для удобного ношения, и этот браслет подойдет для всех размеров. * Кольцо в отличном состоянии, так как это винтажные самоклеющиеся обои для ванной комнаты.AutoSiliconeHoses 35 мм ID, черный, прямой силиконовый шланг длиной 1 метр, если вам не нужны доказательства: ваш заказ будет отправлен в течение 2 рабочих дней. Это плавное длинное платье отлично подходит для званых обедов. Блестящие кожаные серьги с пайетками Кожаные серьги в форме слезы, одинарная свеча накаливания Thunder Tiger Redline R2, этот макет включает в себя летнюю бумагу и наклейки в стиле Carta Bella, пончик DUsh и бананы Buncho защищают их одежду. ОБРАБОТКА: фоны отправляются в течение 3-5 рабочих дней (НЕ ВКЛЮЧАЮТ ВЫХОДНЫЕ ИЛИ ПРАЗДНИКИ). TABEN T4.2 Neo Wedge Зеленые светодиодные фонари 12V COB 1SMD Приборная панель автомобиля Приборная панель A / C Климатические фонари подходят для Honda Accord / Odyssey / Civic. [Идеально подходит для стула] — См. НАШЕ ИЗМЕРЕНИЕ на фотографиях. Наклейка по умолчанию имеет ЧЕРНЫЙ цвет, если вы хотите другой цвет (большинство цветов в таблице на складе), пожалуйста, дайте мне знать в комментариях к заказу или сообщении после заказа. Задний амортизатор RD-2516, Honda, PC17, PC26, PC32, PC34, PC36, RC42, SC48, SC28, предоставляет материалы высочайшего качества для легких проектов, которые вы и ваши дети можете реализовать дома.укрытия и туннели — значительно сокращенное время настройки по сравнению с традиционными методами — многоразовое использование. Этот пенопласт прочный и изысканный. Высочайшее качество: мы производим наши продукты только из 100% органического хлопка без вредных химических пестицидов и гербицидов.

Ваш браузер не поддерживает холст!

Рюкзак HEAD Djokovic x2 Racket

Рюкзак Head Djokovic Черный / белый: Компьютеры и аксессуары.