Повышенный иммунитет: Заболевания иммунной системы › Клиника «Форпост» — БЛОГ О ЗДОРОВОМ ОБРАЗЕ ЖИЗНИ И СОВЕРШЕНСТВОВАНИИ ТЕЛА

Содержание

Почему аутоиммунные болезни у женщин бывают чаще — Wonderzine

Компоненты иммунной системы мужчин и женщин работают неодинаково. Например, тучные клетки, которые одними из первых реагируют на инфекцию, у женщин вырабатывают и запасают больше веществ, провоцирующих воспаление (гистамина, серотонина, протеаз). Эти вещества отвечают, в частности, за такие симптомы, как заложенность носа, мигренозная головная боль, ощущение нехватки воздуха. Разница в работе тучных клеток — генетическая; выяснилось, что более 4 тысяч генов более активны в женских тучных клетках, чем в мужских. Это как раз гены, которые кодируют белки, участвующие в синтезе и хранении воспалительных веществ.

Другой важный элемент иммунитета — так называемый главный комплекс гистосовместимости (ГКГС). Его белки есть во всех клетках организма; они распознают чужеродные молекулы, идентифицируют их и могут передавать другим иммунным компонентам сигналы о том, что пора действовать. Проще говоря, это важные регуляторы иммунных процессов.

Важно, что белки ГКГС крайне разнообразны — они могут быть идентичными разве что у однояйцевых близнецов. В Университете Лунда было проведено исследование на певчих птицах, где выяснилось, что у самцов разнообразие белков ГКГС было недостаточно большим, а у самок, наоборот, чрезмерным — теоретически иммунная система последних могла расценивать слишком много молекул как чужеродные. Поскольку иммунитет разных позвоночных устроен схоже, это может стать шагом на пути к пониманию различий в его работе у мужчин и женщин.

Мы уже рассказывали про иммунные контрольные точки — молекулы, с помощью которых клетки злокачественных опухолей могут подавлять иммунную реакцию; именно за их обнаружение Джеймс Эллисон и Тасуку Хондзё получили Нобелевскую премию. Это открытие позволило создать радикально новые онкологические лекарства, но не только: учёные говорят о возможных различиях в работе этих молекул у мужчин и женщин, что тоже может влиять на восприимчивость к разным заболеваниям.

Иммунитет может и навредить — vechnayamolodost.

Опасный высокий иммунитет: не поднимать!

MedikForum

Словосочетания «высокий иммунитет», как поднять иммунитет» стали привычными и кажутся однозначно положительными. Между тем, высокий иммунитет может быть угрожающим, а поднимать его – попросту опасно. О том, что к иммунитету следует подходить внимательно и взвешенно, рассказывает врач-терапевт многопрофильной клиники «Альфа– Центр Здоровья» Наталья Середенко.

Иммунитет – невосприимчивость, сопротивляемость организма инфекциям и инвазиям чужеродных организмов (вирусам, бактериям, простейшим, паразитам), воздействию чужеродных веществ. Еще одна важная роль отводится противоопухолевой функции иммунитета.

Биологический смысл иммунитета – обеспечение генетической целостности организма на протяжении его индивидуальной жизни. Без системы иммунитета невозможно было бы развитие высокоорганизованных организмов.

Проблема слабого иммунитета довольно часто освещается и обсуждается.

А бывает ли иммунитет слишком высоким?

Иммунитет не может быть высоким или низким, это термины, применяемые в кругу обывателей. Иммунитет – это сложная система органов, тканей, клеток, биологически активных веществ, с помощью которых осуществляется иммунный ответ в организме. Правильнее будет сказать, что иммунный ответ может быть нормальным (адекватным), и патологическим. А вот патологический иммунный ответ возникает в результате различных «поломок» в системе иммунитета, можно сказать, что иммунная система как бы «превышает свои полномочия».

Примером такого неправильного, неадекватного иммунного ответа может стать всем хорошо известная аллергия или гипереактивность организма, когда чужеродное вещество – антиген, а это может быть пища, пыльца, перхоть животных, продукты жизнедеятельности бактерий и насекомых, лекарства или химические соединения и т.д., вызывает в организме слишком «бурную» реакцию иммунного ответа, что проявляет себя в виде аллергических реакций с самыми разными проявлениями – насморк, слезотечение, сыпь, отдышка, удушье, диарея, а в тяжелых случаях приводит к угрожающим жизни состояниям, таким как анафилактический шок или выраженный приступ удушья (астматический статус).

Другой вид «поломок» в иммунном ответе – аутоиммунные реакции, которые приводят к возникновению аутоиммунных заболеваний. Эти реакции возникают, когда клетки иммунной системы – лимфоциты начинают поражать и уничтожать собственные клетки и ткани организма. Причиной таких «поломок» и «сбоев» могут быть вирусные и бактериальные инфекции, неблагоприятные экологические условия, химическая загрязненность окружающей среды, а также отягощенная наследственность. Примером заболеваний с аутоиммунным механизмом развития служат ревматоидный артрит, гломерулонефрит, системная красная волчанка, различные васкулиты (воспаление сосудистой стенки), гепатиты, панкреатиты, заболевания щитовидной железы (аутоиммунный тиреоидит) и другие.

В каких случаях иммунитет поднимать нельзя? Может ли это быть опасным?

Именно в случаях с аутоиммунными заболеваниями, потому что при использовании иммуностимулирующих препаратов процесс будет прогрессировать, и дальнейшее развитие событий предугадать будет сложно. Причем любое агрессивное воздействие на организм может спровоцировать ухудшение состояния, будь то парная баня или инсоляция.

Бывают ли случаи, когда иммунитет приходится искусственным образом занижать? Каким образом это делается?

Иммуносупрессивную терапию, проще говоря, медикаментозное торможение иммунного ответа, приходится использовать для лечения все тех же аутоиммунных заболеваний. С этой целью используются препараты из группы глюкокортикоидов, например преднизолон или метилпреднизолон, а также цитостатики, в онкологии также применяют лучевую терапию.

Иммунитет подразделяется на врожденный и приобретенный. Врожденный иммунитет – это генетическая невосприимчивость к заболеваниям, которыми болеют животные или птицы. Приобретенный иммунитет – это иммунитет, который мы «зарабатываем» в течение всей жизни, встречаясь с различными инфекциями и чужеродными частицами. Также иммунитет подразделяется на клеточный и гуморальный. В понятие клеточного иммунитета входит деятельность клеток иммунной системы – Т-лимфоцитов, клеток-киллеров, макрофагов (моноцитов) и др., в понятие гуморальный иммунитет – деятельность антител, которые вырабатываются В-лимфоцитами в костном мозге.

Как определить, нормально ли функционирует у человека иммунная система?

Во-первых, необходимо выяснить имеются ли клинические проявления сниженного иммунитета: склонность к частым простудным заболеваниям, гнойничковым высыпаниям, фурункулезу, длительно незаживающим микроповреждениям кожи, имеются ли увеличенные лимфатические узлы, длительный субфебрилитет, имеются ли изменения в обычном клиническом анализе крови. Более глубоким исследованием является развернутая иммунограмма с определением функции различных звеньев иммунитета, интерпретацию которой должен давать специалист– иммунолог и в случае выявления каких-либо нарушений назначать адекватное лечение.

Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost. ru
24.04.2012

Иммунитет и аллергия — как они связаны?

Каждый из нас наверняка слышал о том, что аллергические реакции напрямую зависят от состояния иммунной системы. Но каким образом нарушения иммунитета обуславливают появление аллергии?

Что такое иммунитет?

Иммунитет (от лат. immunitas, что значит «освобождение» или избавление от чего-либо) – это невосприимчивость и сопротивляемость организма инфекциям, а также воздействию чужеродных веществ, которые обладают токсичными свойствами.

Иммунитет делится на врожденный и приобретенный.

Врожденный, или неспецифический, иммунитет обусловлен физиологическими и анатомическими особенностями организма, наследственно закрепленными на клеточном или молекулярном уровне. К этому виду иммунитета относятся такие свойства, как невосприимчивость всех людей к собачьей чумке или невосприимчивость некоторых к туберкулезу.
Приобретенный иммунитет возникает после контакта с инфекцией или чужеродным белком. Он делится на активный и пассивный.
- Активный приобретенный иммунитет развивается после перенесенного заболевания или же после введения вакцины. То есть после контакта с возбудителем болезни.
- Пассивный приобретенный иммунитет связан с поступлением в организм готовых антител. Антитела, или иммуноглобулины – это специфические вещества, которые могут вырабатываться клетками иммунной системы и предназначены для нейтрализации инфекционных тел и токсичных продуктов их жизнедеятельности. Но антитела могут и поступать в организм извне в виде сыворотки, а также при передаче их с молоком матери или внутриутробным способом.

Что входит в нашу иммунную систему?

Иммунная система включает в себя два типа защиты: клеточную и гуморальную. Клеточный тип – это иммунокомпетентные клетки (например, Т-лимфоциты), отвечающие за уничтожение чужеродных инфекционных микроорганизмов, попадающих в наше тело. Гуморальный тип объединяет иммунокомпетентные клетки (например, В-лимфоциты), которые продуцируют специфические антитела для борьбы с инфекцией и токсичными чужеродными молекулами.

Органы иммунной системы

Органы иммунной системы делят на центральные и периферические.

— Красный костный мозг является центральным органом кроветворения и производства клеток иммунной системы. Он располагается в плоских и трубчатых костях.
Тимус, или вилочковая железа, – центральный орган иммунной системы, в котором происходит окончательное созревание Т-лимфоцитов из предшественников, которые поступают из красного костного мозга.
Лимфатические узлы – это периферические органы иммунной системы, располагающиеся по ходу лимфатических сосудов. Они участвуют как в механизмах гуморального (В-типа), так и клеточного (Т-типа) иммунитета, в том числе и в развитии аллергических реакций.
Селезенка – самый крупный орган иммунной системы. Он также участвует в Т- и в В-иммунитете, а также обеспечивает превращение моноцитов в макрофаги.

Как взаимосвязаны иммунитет и аллергия?

Аллергия – это сверхчувствительность иммунной системы, возникающая при повторных воздействиях аллергена на организм. На сегодняшний день описано 5 типов реакций такой гиперчувствительности. Но аллергией называется только одна из них, обусловленная выработкой и воздействием иммуноглобулина Е в ответ на попадание в организм чужеродных белков.

Аллергия характеризуется чрезмерной деятельностью тучных клеток, которая переходит в общий воспалительный ответ. Также он может приводить к различным доброкачественным симптомам:

насморку;
кожному зуду;
рези в глазах;
отекам;
крапивнице;
чиханию и кашлю.

Кроме того, при выраженных реакциях могут развиваться и опасные для жизни состояния, такие как анафилактический шок или отек Квинке.

Следует различать аллергию и аутоиммунные реакции. Аутоиммунный процесс возникает в случае, когда защитные механизмы начинают атаковать клетки собственных тканей организма. Аллергия всегда является реакцией на чужеродные соединения.

Почему развивается аллергия?

Многочисленные исследования свидетельствуют о наследственной предрасположенности к аллергиям. Ребенок, чьи родители страдают этой патологией, подвержен большему риску возникновения аллергии, чем дети от здоровых пар.

Теория влияния гигиены утверждает, что соблюдение гигиенических норм предотвращает контакты организма со многими патологическими микроорганизмами и токсичными веществами. Это приводит к недостаточной нагрузке на иммунную систему, особенно у детей. Наш организм сконструирован так, что он должен постоянно противостоять определенному уровню угроз и внешних проникновений. И если такой постоянной «тренировки» и поддержания тонуса иммунной системы не происходит, то она начинает все более выражено реагировать на вполне безобидные вещества.

Статистические данные свидетельствуют, что различные иммунологические заболевания в странах третьего мира встречаются гораздо реже, чем в развитых. Более того, чем больше времени проходит от момента иммиграции, тем чаще иммигранты из развивающихся стран страдают иммунными расстройствами. И по мере роста благосостояния, а, соответственно, чистоты и соблюдения гигиенических норм в стране у ее населения увеличивается количество случаев возникновения аллергии.

Теория увеличения потребления продуктов химической промышленности также подтверждается научными исследованиями. Многие химические продукты сами по себе могут являться довольно сильными аллергенами. Кроме того, они зачастую создают предпосылки для возникновения аллергических реакций, поскольку способны нарушать функции эндокринной и нервной системы.

Однако однозначного объяснения, почему одинаковые факторы действуют на одних людей и не действуют на других, пока не существует. С уверенностью можно сказать одно: здоровый образ жизни, правильное сбалансированное питание, отказ от вредных привычек и забота о собственном организме станут отличным подспорьем для недопущения развития аллергии.

Майорова Л.Н.

Слишком активный иммунитет портит психику

«Повышенная боевая готовность» иммунной системы сопровождается повышенным риском психических расстройств.

Когда мы подхватываем инфекционную болезнь, будь то грипп или желудочно-кишечное расстройство, наш иммунитет прилагает все усилия, чтобы от неё избавиться. Молекулярно-клеточные характеристики иммунного ответа очень сложны, и обычно весь комплекс процессов, запускаемых при инфекции, определяется как воспаление. При этом в кровь выбрасывается огромное количество сигнальных белков, с помощью которых иммунитет организует работу клеток. Один из самых известных – белок интерлейкин-6 (IL-6), который стимулирует иммунный ответ и может действовать как провоспалительный и антивоспалительный сигнал.

Депрессия может быть следствием слишком высокой активности иммунитета. (Фото Tetra Images / Corbis).

‹

›

Но даже если мы здоровы, в организме всё равно присутствует некоторое количество воспалительных белков, уровень которых может быть выше или ниже, в зависимости от того, как работают регуляторные иммунные механизмы. Исследователи из Кембриджа попытались оценить, может ли воспаление влиять на психическое здоровье в долгосрочной перспективе. О том, что состояние иммунитета тесно связано с состоянием нервной системы, говорится давно. Известно, например, что воспаление может ухудшать память и даже провоцировать болезнь Альцгеймера, и что антибиотики и противовоспалительные препараты улучшают состояние больных шизофренией.

В статье, опубликованной Питером Джонсом и его коллегами в журнале JAMA Psychiatry, эти наблюдения подтверждаются масштабной статистикой, охватывающей почти 10 лет – у детей регулярно брали анализы крови, начиная с того времени, когда детям было 9 лет, и до их 18-летнего возраста. В крови среди прочего измеряли уровень воспалительного интерлейкина-6. По количеству IL-6 детей разделили на три группы: те, у кого его в среднем было мало, не очень много и много. И вот оказалось, что те, у кого уровень интерлейкина-6 был стабильно выше, к 18 годам в два раза чаще страдали от депрессий и психозов, нежели те, у кого его уровень был низким.

Повышенная готовность иммунитета к воспалению, разумеется, влияет не только на психическое состояние. Медики неоднократно убеждались в том, что на фоне хронического воспаления могут развиваться сердечно-сосудистые болезни и диабет. Причина же повышенной активности иммунитета может уходить корнями в ранние этапы развития: стресс, неблагоприятные условия, перенесённые во время внутриутробного развития или в детстве, перегревают иммунитет, который даже в отсутствие патогенов поддерживает в себе тлеющий околовоспалительный уровень активности. Тогда становится понятно, почему диета и физические упражнения, которые призваны оздоровить сердце и сосуды, положительно влияют и на настроение: видимо, они действуют на процессы, от которых зависит и состояние психики, и состояние физиологии.

Впрочем, что именно это за процессы и какие между ними есть причинно-следственные связи, учёным ещё предстоит выяснить. Одна из главных загадок здесь связана с гематоэнцефалическим барьером (ГЭБ), который защищает мозг от того, что плавает в крови, в том числе и от иммунных клеток и белков (для борьбы с инфекциями у мозга есть собственный «департамент» иммунной системы, образованный клетками нейроглии). Но депрессия и психозы коренятся в мозге, и как в таком случае воспаление в организме может провоцировать психологические аномалии, если воспалительные сигналы не проходят через ГЭБ? Впрочем, гипотезы на этот счёт есть, и по одной из них дело тут не обходится без блуждающего нерва. Он связывает мозг с глоткой, пищеводом, лёгкими, сердцем, желудком и кишечником. В кишечнике блуждающий нерв может получать воспалительный сигнал, который передаёт в мозг, из-за чего в центральной нервной системе меняется обмен веществ – начинает активно распадаться нейромедиатор серотонин, необходимый в том числе и для положительных эмоций, и начинают накапливаться токсичные вещества, провоцирующие психотическое состояние.

Кто никогда не заболеет Covid-19

Зария Горветт
BBC Future

9 сентября 2020

Автор фото, Unsplash

Последние исследования показали, что антитела к Covid-19 могут исчезать уже через несколько месяцев. Однако, возможно, иммунитет к этой болезни формируют вовсе не они, а загадочные Т-клетки. Новые выводы ученых обнадеживают.

Ключи к разгадке формировались постепенно. Сначала исследователи обнаружили пациентов, одолевших Covid-19, но странным образом не имевших к нему антител. Далее выяснилось, что таких людей может быть много.

Затем стало известно, что у многих антитела сначала появились, но через несколько месяцев исчезли.

Иными словами, хоть антитела и помогают отследить распространение пандемии, очевидно, они не настолько важны для иммунитета, как мы считали раньше.

Если нам нужна долговременная защита от коронавирусной болезни, ее придется искать в другом месте.

Пока весь мир был занят антителами, исследователи начали понимать, что существует другая форма иммунитета, которая годами скрывается в нашем организме.

Речь идет о довольно загадочных Т-лимфоцитах, которые могут сыграть решающую роль в нашей борьбе с Covid-19.

Это иммунные клетки, главная задача которых — выявлять и обезвреживать возбудителей, попавших в клетки или уничтожать сами инфицированные клетки. Белки на поверхности Т-клеток соединяются с белками на поверхности непрошеных гостей в организме, разрушая их таким образом.

Автор фото, Getty Images

Т-клетки имеют триллионы возможных версий поверхностных белков, каждый из которых распознает различные мишени. Поскольку Т-клетки остаются в крови в течение многих лет после перенесенной инфекции, они также способствуют формированию «долговременной памяти» иммунной системы и позволяют ей быстрее и эффективнее реагировать, когда она снова сталкивается со старым врагом.

Несколько исследований показали, что у людей, переболевших Covid-19, остаются Т-клетки, способные распознавать вирус, независимо от того, ощущают они симптомы болезни или нет.

Это понятно. Впрочем, недавно ученые обнаружили более загадочный нюанс. Выяснилось, что у некоторых людей тест на антитела к Covid-19 может быть отрицательным, а на Т-клетки, способные распознать вирус, — положительным.

Это заставило предположить, что определенный уровень иммунитета против заболевания может быть вдвое более распространенным, чем считалось ранее.

Однако самой большой загадкой стало то, что ученые обнаружили специфичные к Covid-19 Т-клетки в образцах крови, взятых за годы до начала пандемии.

Получается, что некоторые люди уже имели определенную степень иммунитета к коронавирусу, еще до того как им заболел первый человек.

Как выяснилось, на удивление много людей, 40-60% из тех, кто никогда не контактировал с вирусом, имеют такие Т-клетки.

Похоже, что Т-клетки и являются тайным источником иммунитета к Covid-19.

Это открытие также помогает понять некоторые вещи, которые до сих пор оставались загадкой. Во-первых, стремительный рост риска развития болезней с возрастом, а во-вторых, непонятная ученым способность вируса разрушать селезенку.

Автор фото, Martin Keene / PA

Підпис до фото,

СПИД — это и есть болезнь Т-клеток, уничтожающих вирус иммунодефицита человека

Исследование Т-клеток является не только вопросом научной любознательности. Если ученые будут знать, какие аспекты иммунной системы являются важнейшими, они могут разработать эффективные вакцины и методы лечения болезни.

Как формируется иммунитет

О Т-клетках или Т-лимфоцитах мало кто помнит из уроков биологии. Впрочем, чтобы понять их важность для иммунитета, стоит посмотреть на то, что происходит с организмом на поздней стадии СПИДа.

Лихорадка, язвы, усталость, потеря веса, а иногда и раковые опухоли. У больного развиваются тяжелые инфекции, которые вызывают микроорганизмы абсолютно безвредные для здоровых людей, например грибок Candida albicans.

В течение месяцев или лет ВИЧ устраивает своеобразный геноцид Т-клеток, он их подавляет, попадает внутрь и систематически заставляет совершать самоубийство.

«ВИЧ уничтожает большую их часть», — объясняет Эдриан Хейди, профессор иммунологии из Королевского колледжа Лондона и руководитель группы в Институте Фрэнсиса Крика.

«Это показывает, как важны эти клетки, а также то, что одних антител в борьбе с инфекциями недостаточно».

При нормальной иммунной реакции организма, например, на вирус гриппа — на первой линии защиты выступает врожденная иммунная система. Она начинает бить тревогу с помощью лейкоцитов и других химических сигналов.

Это инициирует выработку антител, которая начинается спустя несколько недель.

Автор фото, Getty Images

Підпис до фото,

Появляется все больше доказательств того, что некоторые люди имеют скрытую защиту от Covid-19

«Параллельно с этим, примерно на четвертый-пятый день после заражения, начинают активизироваться Т-лимфоциты, распознающие клетки, зараженные вирусом», — говорит Хейди.

Т-лимфоциты быстро и жестко уничтожают зараженные клетки либо собственноручно, либо с помощью других элементов иммунной системы. Таким образом вирусу не удается превратить здоровые клетки в фабрики по производству своих патогенных копий.

Новость хорошая и плохая

Итак, что нам известно о Т-клетках и Covid-19?

«Глядя на пациентов с Covid-19, а также на тех, кто переболел в легкой форме, можно с уверенностью сказать, что Т-клетки реагируют на коронавирус», — говорит Хейди.

«Это очень хорошая новость для тех, кто занимается разработкой вакцины, потому что мы можем создать Т-клетки, распознающие вирус. Это — хорошая новость».

На самом деле, одна из вакцин, которую сейчас разрабатывают исследователи из Оксфордского университета, уже показала, что, помимо антител, она также побуждает организм к выработке Т-лимфоцитов.

Об эффективности этой вакцины говорить пока рано, но один из членов исследовательской группы сказал BBC News, что первые результаты «чрезвычайно обнадеживают».

Впрочем, есть одно «но». У многих пациентов, госпитализированных с тяжелым течением Covid-19, реакция Т-клеток пошла не совсем по плану.

«То, что происходит со многими Т-клетками в таком случае, немного напоминает свадебную вечеринку или мальчишник, которые вышли из-под контроля. Активность Т-лимфоцитов безумно увеличивается, при этом некоторые клетки просто исчезают из крови».

Автор фото, Reuters / Alkis Konstantinidis

Підпис до фото,

Т-клетки остаются в организме в течение многих лет, формируя долгосрочную память иммунной системы

Одна из теорий гласит: Т-клетки идут туда, где они нужны больше всего, например, в легкие. Однако исследователи считают, что, скорее всего, большая их часть гибнет.

«Вскрытие пациентов с Covid-19 показывает некроз тканей, который является, по сути, гниением», — объясняет профессор Хейди. Прежде всего это проявляется в районе селезенки и лимфатических желез, где обитают Т-клетки.

Плохая новость в том, что некроз селезенки является признаком заболевания Т-клеток, при котором иммунные клетки атакуют самих себя.

«Такую же картину мы наблюдаем у умерших от СПИДа», — говорит исследователь.

«Но ВИЧ — это вирус, который непосредственно инфицирует Т-клетки, они являются его главной мишенью». Однако доказательств того, что коронавирус также способен это делать, пока нет.

«Причин тому может быть много, но единого ответа нет», — говорит Хейди.

«Получается, что Т-клетки могут быть вашей защитой в течение многих лет. Но когда человек заболевает, они же выбивают у него почву из-под ног».

Снижение числа Т-клеток с возрастом также объясняет, почему пожилые люди гораздо тяжелее переносят Covid-19.

«После 30 тимус, или вилочковая железа, начинает сокращаться, уменьшая производство Т-клеток в организме человека», — отмечает профессор иммунологии.

Как это влияет на долгосрочный иммунитет?

Предположение, что коронавирусы вызывают появление устойчивых Т-клеток, недавно подвигло ученых проверить старые образцы крови, взятые у людей между 2015 и 2018 годами.

Тот факт, что иммунная система некоторых из них научилась распознавать Covid-19 задолго до начала пандемии, свидетельствует, что их организм уже сталкивался в прошлом с вирусами гриппа со схожими поверхностными белками.

Автор фото, Reuters

Підпис до фото,

Хоть антитела и очень важны для отслеживания распространения Covid-19, спасут нас в конечном итоге не они

К сожалению, ученые пока не проверяли, появляются ли в организме Т-клетки в ответ на любой из коронавирусов, вызывающих простуду.

«Получить финансирование на такое исследование требует геркулесовых усилий», — говорит Хейди. Исследования ОРВИ вышли из моды в 1980-х годах, они застряли на месте, и ученые начали переходить к другим проектам, например к исследованиям ВИЧ.

Исследователи столкнулись с проблемой: простуду может вызвать любой из сотен вирусных штаммов, многие из которых постоянно мутируют.

Поможет ли это создать вакцину?

Если перенесенные в прошлом простуды способствуют более легкому течению Covid-19, это дает хороший шанс на разработку эффективной вакцины. Ведь это доказывает, что Т-клетки способны обеспечивать защиту в течение длительного времени.

Но даже если это не так, участие Т-клеток все равно может быть полезным, — и чем больше мы понимаем, что происходит, тем лучше.

Хейди объясняет, что способ разработки вакцин зависит от типа иммунной реакции, которую надеются получить ученые. Один из них провоцирует выработку антител — свободных белков, которые могут связываться с патогенными микроорганизмами и нейтрализовать их или транспортировать в другую часть иммунной системы.

Другие виды иммунного ответа могут привлекать Т-клетки или провоцировать реакцию со стороны других элементов иммунной системы.

«На самом деле существует множество способов создания вакцины», — говорит Хейди. Ученого прежде всего радует то, что иммунная система очень хорошо распознает вирус Covid-19 даже у тех пациентов, которые тяжело переносят болезнь.

«Поэтому если мы научимся возмещать ущерб, который коронавирус наносит Т-клеткам, мы сможем гораздо лучше контролировать заболевание».

Похоже, уже скоро мы услышим о Т-клетках гораздо больше.

Прочитать оригинал этой статьи на английском языке вы можете на сайте BBC Future.

Хотите поделиться с нами своими жизненными историями? Напишите о себе по адресу: [email protected], и наши журналисты с вами свяжутся.

Слишком повышенный иммунитет опасен для здоровья

Иммунитет представляет собой сложную систему органов, тканей, клеток, биологически активных веществ, с помощью которых осуществляется иммунный ответ в организме.

Правильнее будет сказать, что иммунный ответ может быть нормальным (адекватным) и патологическим. А вот патологический иммунный ответ возникает в результате различных «поломок» в системе иммунитета, когда, так сказать, иммунная система как бы «превышает свои полномочия».

Примером такого неправильного, неадекватного иммунного ответа может стать всем хорошо известная аллергия или гиперреактивность организма, когда чужеродное вещество — антиген (а это может быть пища, пыльца, перхоть животных, продукты жизнедеятельности бактерий и насекомых, лекарства или химические соединения и т. д.) вызывает в организме слишком «бурную» реакцию иммунного ответа. Он проявляет себя в виде аллергических реакций с самыми разными последствиями: насморк, слезотечение, сыпь, одышка, удушье, диарея, а в тяжелых случаях с угрожающими жизни состояниями, такими, как анафилактический шок или выраженный приступ удушья (астматический статус).

Другой вид «поломок» в иммунном ответе — аутоиммунные реакции, приводящие к возникновению аутоиммунных заболеваний. Они возникают, когда клетки иммунной системы — лимфоциты — начинают поражать и уничтожать собственные клетки и ткани организма. Причиной таких «поломок» и «сбоев» могут быть вирусные и бактериальные инфекции, неблагоприятные экологические условия, химическая загрязненность окружающей среды, а также отягощенная наследственность. Примером заболеваний с аутоиммунным механизмом развития служат ревматоидный артрит, гломерулонефрит, системная красная волчанка, различные васкулиты (воспаление сосудистой стенки), гепатиты, панкреатиты, заболевания щитовидной железы (аутоиммунный тиреоидит) и другие.

В каких случаях иммунитет поднимать нельзя? Может ли это быть опасным?

Как определить нормально ли функционирует у человека иммунная система?

Во-первых, необходимо выяснить, имеются ли клинические проявления сниженного иммунитета: склонность к частым простудным заболеваниям, гнойничковым высыпаниям, фурункулезу, длительно незаживающим микроповреждениям кожи. Проявлением сниженного иммунитета являются также увеличенные лимфатические узлы, длительный субфебрилитет, изменения в обычном клиническом анализе крови. Более глубоким исследованием является развернутая иммунограмма с определением функции различных звеньев иммунитета, интерпретацию которой должен давать врач иммунолог. Он же в случае выявления каких-либо нарушений должен назначить адекватное лечение.

Анализ крови на иммунитет | Семейная клиника А-Медия, Санкт-Петербург

В хроническую стадию большинство инфекционных заболеваний переходят по причине сниженного иммунитета, т. е. когда защитные силы не могут обеспечить полноценную защиту организма человека от внешних и внутренних раздражающих факторов. Чтобы определить, в каком состоянии находится ваша иммунная система, необходимо сделать иммунограмму (анализ на иммунитет).

Сегодня существует порядка 10 видов иммунограмм, и все они определяют разные показатели. Выбор конкретного анализа должен производиться врачом, так как, выбирая самостоятельно, можно ошибиться и не получить необходимого результата, что приведет к напрасной трате денег и времени. Наиболее распространенным является анализ крови на иммунитет. Он дает полноценную информацию о состоянии клеточного и гуморального иммунитета.

В каких случаях необходим анализ крови на иммунитет?

Взрослым и детям рекомендуется сдать анализ на иммунитет в случае:

частых ОРВИ и др. вирусных инфекций
упорной молочницы
гнойничковых высыпаний
аллергических заболеваний
аутоиммунных патологий
рецидивирующего герпеса
хронического гайморита и бронхита.

Данный вид иммунного тестирования поможет выявить, не вызваны ли вышеперечисленные состояния ослаблением иммунной системы, а также даст возможность вовремя предпринять необходимые лечебно-профилактические меры.

Из чего состоит анализ?

Анализ на иммунитет требуется людям с подозрением на отклонения в работе иммунной системы. Данная процедура представляет собой исследование нескольких компонентов иммунитета:

гуморального
клеточного
неспецифического.

Врач самостоятельно решает, какие анализы на иммунитет необходимо делать, учитывая сложность ситуации, историю болезней и результаты уже проведенных исследований.

Подготовка к анализу крови на иммунитет

1. Процедура проводится исключительно натощак – последний прием пищи должен быть не менее чем за 8 часов до планируемого времени сдачи анализа.

2. За 2 недели рекомендуется исключить прием каких-либо лекарственных препаратов. В случае постоянного приема медикаментов, например, при гипертонической болезни или сахарном диабете, в обязательном порядке следует предупредить врача.

3. Не рекомендуется употреблять в пищу острые и жирные блюда за 2-3 дня до процедуры.

4. Запрещено употреблять алкоголь за сутки до исследования и курить за полчаса до забора крови.

5. Не следует проводить обследование во время острого инфекционного заболевания или обострения хронического.

Достоверные результаты анализа на иммунитет может обеспечить только строгое выполнение всех вышеперечисленных рекомендаций.

Результаты анализа

Возможности современной иммунодиагностики позволят любому из вас узнать о состоянии своей иммунной системы и, в случае необходимости, вовремя принять необходимые меры.

Полученные результаты со всей тщательностью изучает врач аллерголог-иммунолог, который может не только правильно их интерпретировать, но и дать квалифицированные рекомендации по дальнейшей тактике ведения выявленного заболевания.

Если вам необходимо определить свой иммунный статус (сдать анализ на иммунитет), то вы можете воспользоваться услугами нашей клиники. Квалифицированный врач аллерголог-иммунолог, имеющий многолетний опыт научной и практической работы, сможет определить причину нарушений в вашем организме и избавить от беспокоящих вас проблем.

Подробнее об услуге вас проинформирует наш администратор по телефону или через форму обратного звонка. Обращайтесь, мы готовы ответить на все ваши вопросы!

Могут ли упражнения повлиять на иммунную функцию, увеличивая восприимчивость к инфекции?

Принадлежности Расширять

Принадлежности

¹ Кафедры диетологии, педиатрии и иммунобиологии, Университет Аризоны, Тусон, Аризона, США.
² Департамент здравоохранения Университета Бата, Клавертон Даун, Бат, BA2 7AY. СОЕДИНЕННОЕ КОРОЛЕВСТВО.
³ Школа биомедицинских наук и фармацевтики, факультет здравоохранения и медицины, Университет Ньюкасла, Каллаган, Новый Южный Уэльс, 2308, Австралия.
⁴ Отделение физиологии упражнений и спортивной терапии, Институт спортивных наук, Университет Юстуса-Либиха, Гиссен, Гиссен, Германия.
⁵ Лаборатория деятельности человека, Государственный университет Аппалачей, Исследовательский кампус Северной Каролины, Каннаполис, Северная Каролина 28081, США.
⁶ Научно-исследовательский институт спорта и физических упражнений, Университет Канберры, Канберра, ACT 2617, Австралия.
⁷ Школа спорта и физических упражнений, Ливерпульский университет Джона Мура, Ливерпуль, Великобритания.

Бесплатная статья

Элемент в буфере обмена

Обзор

Ричард Дж. Симпсон и др.Exerc Immunol Rev. 2020.

Бесплатная статья Показать детали Показать варианты

Показать варианты

Формат АннотацияPubMedPMID

Принадлежности

¹ Кафедры диетологии, педиатрии и иммунобиологии, Университет Аризоны, Тусон, Аризона, США.
² Департамент здравоохранения Университета Бата, Клавертон Даун, Бат, BA2 7AY. СОЕДИНЕННОЕ КОРОЛЕВСТВО.
³ Школа биомедицинских наук и фармацевтики, факультет здравоохранения и медицины, Университет Ньюкасла, Каллаган, Новый Южный Уэльс, 2308, Австралия.
⁴ Отделение физиологии упражнений и спортивной терапии, Институт спортивных наук, Университет Юстуса-Либиха, Гиссен, Гиссен, Германия.
⁵ Лаборатория деятельности человека, Государственный университет Аппалачей, Исследовательский кампус Северной Каролины, Каннаполис, Северная Каролина 28081, США.
⁶ Научно-исследовательский институт спорта и физических упражнений, Университет Канберры, Канберра, ACT 2617, Австралия.
⁷ Школа спорта и физических упражнений, Ливерпульский университет Джона Мура, Ливерпуль, Великобритания.

Элемент в буфере обмена

Полнотекстовые ссылки Опции CiteDisplay

Показать варианты

Формат АннотацияPubMedPMID

Абстрактный

Многочисленные исследования на людях и животных продемонстрировали глубокое влияние физических упражнений на иммунную систему.Существует общее мнение, что регулярные короткие (то есть до 45 минут) упражнения средней интенсивности полезны для иммунной защиты организма, особенно у пожилых людей и людей с хроническими заболеваниями. Напротив, сообщается, что бремя инфекций среди высококвалифицированных спортсменов является высоким и уступает только травме по количеству тренировочных дней, потерянных во время подготовки к крупным спортивным соревнованиям. Это сформировало общее мнение о том, что тяжелые упражнения (то есть те виды деятельности, которые практикуют спортсмены / военнослужащие, которые значительно превышают рекомендуемые нормы физической активности) могут подавлять иммунитет и увеличивать риск заражения.Однако идея о том, что упражнения как таковые могут подавлять иммунитет и увеличивать риск заражения независимо от многих других факторов (например, беспокойства, нарушения сна, путешествий, воздействия, дефицита питания, экстремальных экологических явлений и т. Д.), С которыми сталкиваются эти группы населения, недавно подверглась сомнению. Целью этой дискуссионной статьи было собрать противоположные аргументы, сосредоточенные вокруг этого фундаментального вопроса в области иммунологии упражнений: могут ли упражнения повлиять на иммунную функцию, чтобы повысить восприимчивость к инфекции.Дискуссионные группы оспаривали следующие вопросы: (i) являются ли спортсмены более восприимчивыми к инфекциям (в основном, верхних дыхательных путей), чем население в целом; (ii) способны ли физические упражнения как таковые изменять иммунитет и увеличивать риск инфицирования независимо от множества факторов, которые активируют общие иммунные пути и являются уникальными для исследуемых популяций; (iii) полезность определенных биомаркеров и интерпретация данных in vitro и in vivo для мониторинга иммунного здоровья у тех, кто выполняет тяжелые упражнения; и (iv) качество научных данных, которые использовались для обоснования утверждений за и против потенциальных негативных последствий тяжелых физических упражнений для иммунитета и риска инфицирования.Ключевым моментом согласия между группами является то, что восприимчивость к инфекции имеет многофакторную основу. Вопрос, который еще предстоит решить, заключается в том, являются ли упражнения сами по себе причинным фактором повышенного риска инфицирования спортсменов. Эта статья должна послужить толчком для проведения дополнительных эмпирических исследований, чтобы разгадать сложные вопросы, которые окружают этот спорный вопрос в области физической иммунологии.

Ключевые слова: Спортсмены; Иммунология упражнений; Иммуносупрессия; Открыть окно риска заражения; Инфекции верхних дыхательных путей; физическая активность; стресс.

Процитировано

46 статей

Физические упражнения, инфекции и ревматические заболевания: что мы знаем?
Калабрезе Л., Нейман, округ Колумбия.Calabrese L, et al. RMD Open. 2021 Май; 7 (2): e001644. DOI: 10.1136 / rmdopen-2021-001644. RMD Open. 2021 г. PMID: 34001646 Бесплатная статья PMC. Рефератов нет.
Характеристики тренировок и болезней лыжников, переходящих от младшего к старшему уровню.
Карлссон Ø, Лааксонен М.С., МакГоули К. Karlsson Ø, et al. PLoS One. 2021, 14 мая; 16 (5): e0250088.DOI: 10.1371 / journal.pone.0250088. Электронная коллекция 2021 г. PLoS One. 2021 г. PMID: 33989314 Бесплатная статья PMC.
Влияние COVID-19 на тренировки по плаванию: практические рекомендации в условиях домашнего заключения / изоляции.
Хаддад М., Аббес З., Муджика И., Чамари К. Хаддад М. и др. Int J Environ Res Public Health. 2021 29 апреля; 18 (9): 4767. DOI: 10.3390 / ijerph28094767.Int J Environ Res Public Health. 2021 г. PMID: 33947100 Бесплатная статья PMC. Рассмотрение.
Повышенный риск респираторных вирусных инфекций у профессиональных спортсменов: контролируемое исследование.
Валтонен М., Грёнроос В., Луото Р., Варис М., Ухари М., Хейнонен О. Дж., Руусканен О. Валтонен М. и др. PLoS One. 2021 4 мая; 16 (5): e0250907. DOI: 10.1371 / journal.pone.0250907. Электронная коллекция 2021 г.PLoS One. 2021 г. PMID: 33945550 Бесплатная статья PMC.
Измененная иммуноэмоциональная регуляторная система при COVID-19: от истоков к возможностям.
Пуррияхи Х., Сагазаде А, Резаи Н. Pourriyahi H, et al. J Neuroimmunol. 2021 15 июля; 356: 577578. DOI: 10.1016 / j.jneuroim.2021.577578. Epub 2021 16 апреля. J Neuroimmunol. 2021 г. PMID: 33933818 Бесплатная статья PMC.Рассмотрение.

Условия MeSH

Восприимчивость к болезням / иммунология *

[Икс]

цитировать

Копировать

Формат: AMA APA ГНД NLM

границ | Повышенные иммунные ответы и защитный иммунитет к вирусу Зика, индуцированный ДНК-вакциной, кодирующей химерный NS1, слитый с белком gD

вируса герпеса 1 типа

Введение

Вирус Зика (ZIKV) — это вирус, переносимый членистоногими, с положительной одноцепочечной РНК, которая кодирует три структурных и семь неструктурных белков (1).В то время как классический цикл передачи ZIKV в основном включает комаров Aedes (1, 2), также были продемонстрированы внутриматочные и половые пути передачи (3). По данным ВОЗ, ZIKV зарегистрирован более чем в 80 странах. Инфекции, связанные с этим вирусом, вызывают множество симптомов, начиная от гриппоподобных симптомов, таких как лихорадка, сыпь, конъюнктивит, головная боль и боль в глазах, до тяжелых форм, таких как синдром Гийана-Барре (GBS) и врожденный синдром Зика (CZS) (4) . Последний представляет собой набор пороков развития, которые сильно влияют на развитие новорожденных и могут привести к микроцефалии (5–7).Несмотря на бремя болезни и потребность в разработке подходов к предотвращению распространения вируса, до сих пор нет лицензированных методов лечения или вакцин против инфекции ZIKV.

Несмотря на отсутствие четкой корреляции защиты от инфекции ZIKV, недавние данные показывают, что оптимальная вакцина ZIKV должна вызывать как клеточные, так и гуморальные иммунные ответы (8–10). Индукция ZIKV-специфических нейтрализующих антител (nAb) вакцинами была способна обеспечить защиту мышей и нечеловеческих приматов (NHP).Кроме того, пассивная иммунизация сывороткой, выделенной из вакцинированных или инфицированных NHP или людей, обеспечивала защиту в экспериментальных условиях (11-15). С другой стороны, иммунные ответы, опосредованные Т-клетками, также способствуют контролю инфекции ZIKV. Повышенная вирусная нагрузка и уровень смертности наблюдаются у мышей с дефицитом Т-лимфоцитов CD8 ⁺, в то время как перенос ZIKV-специфических Т-клеток CD8 ⁺ к мышам с дефицитом Т-клеток снижает инфекцию и обеспечивает защиту (16–18). Недавно было показано, что роль Т-хелперных клеток CD4 ⁺ типа I вносит свой вклад в контроль инфекции ZIKV (19–21).Дальнейшие опубликованные данные неоднократно демонстрировали, что ответы как nAbs, так и Т-клеток вносят вклад в защитный иммунитет к инфекции ZIKV (14, 19, 22–24).

Аномально высокая заболеваемость GBS и CZS в определенных местах подняла вопрос, может ли ранее существовавший иммунитет к другим флавивирусу, таким как DENV, быть причастным к такому феномену, вероятно, через антитело-зависимое усиление (ADE). Хорошо известно, что ZIKV и DENV имеют общую перекрестную реактивность с антигенами как на уровне антител (Ab), так и на уровне Т-клеток, и поскольку Abs могут играть двойную роль в защите и патогенезе DENV, то же самое может быть верно и для ZIKV (17, 25).Фактически, исследования с использованием моделей мышей и, совсем недавно, данные на людях уже показали прямую роль антиструктурных белков Abs в патогенезе как DENV, так и ZIKV (26–28). Несмотря на эти доказательства, большинство вакцин ZIKV, протестированных в экспериментальных условиях, нацелено на выработку нейтрализующих антител против структурных антигенов (13, 14, 29–33). Альтернативой может быть использование неструктурных белков в составах вакцин, поскольку эти антигены могут запускать защитные реакции как В-, так и Т-клеток без нежелательных рисков ADE (9).

Неструктурные белки 1 (NS1) флавивируса представляют собой гликопротеины с молекулярной массой от 46 до 55 кДа, участвующие в нескольких механизмах, таких как репликация, синтез отрицательной цепи РНК и уклонение от иммунного ответа хозяина (34). NS1 является высокоиммуногенным и может быть связан с цитоплазматической мембраной в виде димеров или гексамеров, которые секретируются во внеклеточную среду. Сообщалось, что анти-NS1 Abs нацелены на инфицированные клетки и индуцируют клиренс вируса за счет антителозависимой цитотоксичности (ADCC) и отложения белков системы комплемента.Кроме того, клетки, инфицированные ZIKV, также могут быть нацелены на Т-клетки посредством представления MHC эпитопов, происходящих от NS1. Фактически, оба иммунологических ответа генерируют защитный иммунитет к ZIKV. Стратегии вакцины против ZIKV, основанные на рекомбинантном вирусе везикулярного стоматита (rVSV) (35), ДНК-вакцинах (23, 36) или модифицированном вирусе осповакцины Ankara (37), показали разные уровни защиты, вызывая один или оба гуморальных и клеточных ответа. Кроме того, мыши и человеческие изолированные NS1-специфические моноклональные антитела (mAb) показали Fc-зависимую защиту от заражения ZIKV, включая небеременных и беременных мышей (38, 39).Эти результаты показывают, что белок ZIKV NS1 является подходящим антигеном для вакцин, основанных на различных платформах доставки.

Предыдущие исследования показали, что генетическое слияние антигенов в С-концевой области гликопротеина D (gD) вируса простого герпеса типа I (HSV-1) может улучшить индукцию антиген-специфических гуморальных и клеточных иммунных ответов, либо на основе платформа ДНК-вакцин или очищенные рекомбинантные белковые вакцины (40–42). GD HSV-1 способен с высокой аффинностью связываться с несколькими антигенпредставляющими клеточными рецепторами, включая нектин-1 и медиатор проникновения вируса герпеса (HVEM) (43), который является членом рецептора фактора некроза опухоли (TNFR). семья.Взаимодействие gD и HVEM индуцирует экспрессию NF-κB RelA TRAF2-зависимым образом, что приводит к сигналам, способствующим выживанию, в активированных Т-клетках (44, 45). Связывание gD с HVEM вызывает сильные иммуномодулирующие эффекты на Т-клетки, как ранее было продемонстрировано нашей группой и другими (40, 41, 46–49).

В этом исследовании мы разработали и протестировали ДНК-вакцину, основанную на экспрессии химерного белка NS1 ZIKV, генетически слитого с белком gD HSV-1, для усиления иммунных ответов против NS1 и защитного иммунитета к ZIKV.Иммунизация иммунокомпетентных мышей ДНК-вакциной вызвала повышение сывороточных титров NS1-специфических IgG, а также NS1-специфичных IFNγ-секретирующих клеток, по сравнению с мышами, иммунизированными вектором, кодирующим только NS1. Присутствие gD также коррелировало со снижением заболеваемости и смертности, индуцированных у иммунодефицитных мышей AB6, зараженных ZIKV. Эти результаты подтверждают использование антигена NS1 в стратегиях вакцинации против ZIKV и подтверждают адъювантные эффекты, связанные с коэкспрессией белка gD HSV-1.

Материалы и методы

Заявление об этике

Самцов или самок мышей C57BL / 6 (в возрасте 6–8 недель) или AB6 (IFNAR1 — / -) (в возрасте 4 недель) разводили в определенных условиях, свободных от патогенов, в отделении изогенных мышей кафедры микробиологии Университета г. Сан-Паулу, Бразилия. Протоколы были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных (CEUA) Университета Сан-Паулу (номер протокола 96/2016) и проводились в соответствии с Этическими принципами экспериментов на животных, установленными Бразильским колледжем экспериментов на животных.Размер группы животных был определен для достижения мощности разрешения 80% с использованием платформы Experimental Design Assistant (EDA) (https://eda.nc3rs.org.uk/).

Плазмиды и рекомбинантные белки

ДНК-вакцины, кодирующие полноразмерный ZIKV NS1 (GenBank: ALU33341), выделенный (pNS1-ZIKV) или в виде химерного белка, генетически слитый с белком gD HSV-1 (pgDNS1-ZIKV), были синтезированы в GenScript, США (рис. 1A). . Синтетические гены были оптимизированы для использования кодонов человека и сконструированы так, чтобы они содержали сайты рестрикции PstI и BglII на N ‘и C’ конце соответственно.Последовательности клонировали в вектор pUMVC3 (Aldevron, ND, США), как описано ранее (47). Для конструкции pgDNS1-ZIKV последовательность полноразмерного ZIKV NS1 фланкирована сайтами рестрикции ApaI (дополнительная фигура 1). Штамм Escherichia coli DH5α трансформировали рекомбинантными плазмидами отдельно, и плазмидную ДНК очищали с использованием набора EndoFree Plasmid Mega (Каталожный номер 12183, QIAGEN) в соответствии с инструкциями производителя. Конструкции были подтверждены рестрикционным анализом и секвенированием генов.

Рисунок 1 . Экспрессия рекомбинантного ZIKV NS1 и химерного ZIKV NS1 и HSV-1 gD. (A, B) Схематическое изображение pNS1-ZIKV, кодирующего полноразмерный белок NS1 ZIKV (A) и pgDNS1-ZIKV, кодирующего генетическое слияние NS1 и gD (B). (C – E) Обнаружение ZIKV NS1, экспрессированного в клетках HEK293-T, через 24 часа после трансфекции тестируемыми плазмидами. Клетки метили mAb против ZIKV NS1, а затем антителами против IgG мыши, конъюгированными с Alexa Fluor 488, и анализировали проточной цитометрией (C, D) и иммунофлуоресценцией (E) .Данные выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего из двух независимых экспериментов, проведенных в двух экземплярах. Масштабная линейка = 400 мкм. Статистическую значимость рассчитывали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с послетестовым тестом Бонферрони (** p <0,01, **** p <0,0001, NS = не значимо).

Белок ZIKV NS1 был экспрессирован на рекомбинантных клетках E.coli BL21-CodonPlus (DE3) -RIL и очищен с помощью аффинной хроматографии после рефолдинга белка in vitro в условиях высокого давления, как описано ранее (50).

Линии вирусов и клеток

Бразильский клинический изолят ZIKV (ZIKV ^BR) (GenBank: KU729217.2) был получен из Института Эвандро Шагаса в Белене (Пара, Бразилия). Размножение ZIKV ^BR проводили в клетках клона C6 / 36 Aedes albopictus , культивированных в среде Leibovitz L-15 (Vitrocell, Бразилия) с добавлением 2% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (Life Technologies, США), с последующим культивированием протокол концентрации, как описано ранее (5, 51). Клетки Vero CCL-81 культивировали в Minimum Essential Medium Eagle (MEM, Vitrocell) с 10% FBS.Эмбриональные клетки почек человека (клетки HEK-293, ATCC № CRL-11268) культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM, Life Technologies), с добавлением 10% FBS.

Обнаружение ЗИКВ НС1

Экспрессию белка ZIKV NS1 определяли либо с помощью иммунофлуоресценции, либо с помощью проточной цитометрии. В обоих случаях клетки HEK-293 в равной степени трансфицировали плазмидами в соответствии с ранее описанным протоколом (52). Вкратце, клетки HEK-293 высевали (10 ⁵ клеток / лунку) в 24-луночные планшеты (Corning, США) и культивировали при 37 ° C (5% CO ₂) до достижения слияния 70–80%.За час до трансфекции супернатант клеточной культуры удаляли и к клеткам добавляли 200 мкл / лунку DMEM (с добавлением 2% FBS). Для трансфекции готовили растворы MIX, содержащие от 1 мкг плазмид до 3 мкг полиэтиленимина (PEI) (каталожный номер: 408727, Sigma Aldrich, США) в 150 мМ растворе NaCl. После инкубации в течение 5 минут при комнатной температуре (RT) смеси равномерно распределяли по планшетам, и клетки инкубировали до 24 часов (37 ° C, 5% CO ₂).

Для обнаружения ZIKV NS1 монослои трансфицированных клеток промывали (2 ×) PBS и фиксировали 4% формальдегидом, разведенным в PBS, в течение 15 мин (RT). После инкубации клетки подвергали проницаемости с помощью 0,1% Тритона Х-100 в PBS (15 мин при комнатной температуре) и блокировали блокирующим раствором (BS) (2% BSA, разведенный в PBS) в течение 30 минут при комнатной температуре. После нового цикла промывки (3 ×) клетки окрашивали mAb против ZIKV NS1 4h3 (20 мкг / мл), разведенными в BS, и выдерживали в течение 1 ч при комнатной температуре (RT) при перемешивании. После промывки (3 ×) 0.05% Tween 20 в PBS (PBS-T), клетки инкубировали (45 мин при комнатной температуре) с антителом против IgG мыши, конъюгированным с AlexaFluor 488 (каталожный номер A11001, Invitrogen, США). Наконец, клетки промывали PBS-T и наблюдали под иммунофлуоресцентным микроскопом (Evos FL Thermo Scientific, США) с изображениями, полученными при 100-кратном увеличении.

Для анализов проточной цитометрии монослои клеток промывали 2 раза PBS, трипсинизировали и фиксировали / пермеабилизировали с помощью набора Cytofix / Cytoperm (BD Bioscience, США) в соответствии с инструкциями производителя.Затем клетки окрашивали первичным антителом 4h3 mAb (5 мкг / мл) на льду в течение 30 мин. После отмывки (2 ×) клетки инкубировали (30 мин на льду) с антимышиным антителом, конъюгированным с Alexa Fluor 488 (каталожный: A11001, Thermo Fisher Scientific), разведенным 1: 800. Наконец, после промывок (2 ×) клетки суспендировали в 200 мкл раствора PBS-2% FBS и анализировали с помощью анализатора LSR FortessaTM (BD, Franklin Lakes, NJ, USA). Полученные данные анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo (версия 10, Tree Star, Сан-Карло, Калифорния) для определения процента окрашенных клеток.

Мыши и схема иммунизации

Мышей C57BL / 6 (5–7 животных в группе) или AB6 (4–6 животных в группе) иммунизировали 2 дозами по 50 мкг pUMVC3, pNS1-ZIKV или pgDNS1-ZIKV, приготовленных в апирогенном физиологическом растворе (0,9%). . Для иммунизации животных предварительно анестезировали смесью кетамина и ксилазина (100 и 10 мг / кг соответственно), вводимой внутрибрюшинно (i.p.). Затем животным вводили внутримышечные (в / м) инъекции составов с последующей электропорацией (два импульса 130 В длительностью 1 мс и четыре импульса 70 В длительностью 50 мс с интервалом 450 мс между каждым импульсом), которая проводилась. с CUY560-5-0.5 с использованием NEPA21 Super Electroporator (Nepa Gene Co, Япония) с интервалом в 2 недели. Образцы крови получали пункцией подчелюстного сплетения через 14 дней после введения каждой дозы и центрифугировали при 3000 g в течение 30 мин для отделения сыворотки. Полученные образцы сыворотки хранили при -20 ° C для дальнейшего анализа.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Планшеты для ELISA с высоким связыванием

(Corning) покрывали очищенным белком ZIKV NS1 (200 нг / лунку), разведенным в буфере для покрытия (32.5 мМ NaHCO ₃, 14,9 мМ Na ₂ CO ₃, pH 9,6) в течение 18 часов при 4 ° C. Планшеты трижды промывали PBS, содержащим 0,05% Tween-20 (PBS-T), и добавляли 200 мкл / лунку блокирующего буфера (BB), содержащего 5% обезжиренный молочный раствор с 1% бычьим сывороточным альбумином (BSA). в PBS-T. После инкубации (2 ч при 37 ° C) планшеты промывали (3 ×) и 100 мкл отдельных образцов сыворотки, предварительно разведенных (начиная с 1:25) в BB, добавляли в лунки и инкубировали в течение 1 часа при 37 ° C. ° C.После нового цикла отмывки (3 ×) в лунки добавляли антитело против мышиного IgG, конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP) (Sigma Aldrich) при разведении 1: 4000 в BB. Для определения подклассов IgG использовали антитела против мышиного IgG1 или IgG2c, конъюгированные с HRP (Southern Biotech, США). После инкубации (1 час, 37 ° C) планшеты промывали (3 ×) и в каждую лунку добавляли 100 мкл проявляющего раствора, содержащего о-фенилендиамин дигидрохлорид (OPD) (Sigma Aldrich) и H ₂ O ₂. и инкубировали 15 мин при комнатной температуре в темноте.Реакцию останавливали добавлением 50 мкл / лунку 1 М серной кислоты и оптическую плотность измеряли при 492 нм (Ab _{492 нм}) с помощью планшет-ридера (BioTek, Winooski, VT, USA). Титры антител определяли как значение обратного конечного разведения образца сыворотки, при котором полученная абсорбция была по крайней мере на 0,1 единицы выше порогового значения (среднее + 2 стандартное отклонение для Ab _{492 нм}, полученного на лунках, не содержащих сыворотки).

Связывание антитела

с нативным белком NS1

Клетки Vero высевали (5 × 10 ⁴ клеток / лунку) в плоские 96-луночные планшеты (Corning) и инкубировали в течение 24 ч при 37 ° C (5% CO ₂).Созданные монослои клеток инфицировали ZIKV ^BR при множественности инфицирования (MOI) 1,0 в течение 24 ч (37 ° C, 5% CO ₂). После инфицирования монослои промывали PBS (2 ×), трипсинизировали (Vitrocell) и фиксировали / повышали проницаемость с помощью набора Cytofix / Cytoperm (BD Bioscience) в соответствии с инструкциями производителя. Клетки метили объединенными образцами сыворотки от иммунизированных мышей, разведенных 1: 1000 или 4h3 mAb (5 мкг / мл) в течение 30 минут на льду. После отмывки (2 ×) клетки окрашивали в течение 30 мин (на льду) козьим антителом против IgG мыши, конъюгированным с Alexa Fluor 488, разведенным 1: 800 (Кат.: A11001, Thermo Fisher Scientific). После новых циклов промывки (2 ×) клетки суспендировали и анализировали в анализаторе LSR FortessaTM (BD, Franklin Lakes, NJ, США). Данные анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo (версия 10, Tree Star, Сан-Карло, Калифорния) для определения процента окрашенных клеток Vero.

Синтез пептидов

Пептиды, использованные в этой работе, были синтезированы в GenScript USA Inc. Прогнозирование иммуногенных регионов осуществлялось с помощью алгоритма (53, 54), размещенного в Immune Epitope Database (IEDB) Tools (http: // tools.iedb.org/mhci/), используя аминокислотную последовательность, соответствующую С-концевой части нативного белка ZIKV NS1 (GenBank – ALU33341). Аффинность связывания была получена для всех 8–14-мерных пептидов для аллелей h3-Kb и h3-Db. Отобранные аллели имели классификацию консенсусного процента, ограниченную 1,7% с оценкой ≤1. Были отобраны два пептида с прогнозируемым высоким баллом, изготовленные на заказ GenScript (Пискатауэй, Нью-Джерси, США), суспендированные в ДМСО и хранящиеся при -80 ° C перед использованием.

Анализ клеточного иммунного ответа

Измерение индуцированных клеточных иммунных ответов проводилось в соответствии с ранее описанным адаптированным протоколом (16).Вкратце, через 2 недели после введения последней дозы вакцины иммунизированных мышей внутривенно (в / в) инфицировали 10 ⁶ бляшкообразующих единиц (БОЕ) ZIKV ^BR. Через три дня после заражения (d.p.i) животных умерщвляли, селезенки собирали хирургическим путем в асептических условиях и выделяли спленоциты, как описано ранее (52). Затем изолированные клетки селезенки стимулировали in vitro пептидами, полученными из ZIKV NS1, и количество клеток, продуцирующих IFNγ, определяли с помощью иммуноабсорбирующего пятна с ферментной связью (ELISpot).

ELISpot проводили согласно ранее описанному протоколу (55). Вкратце, спленоциты от иммунизированных и инфицированных мышей высевали (2 × 10 ⁵ клеток / лунку) в 96-луночные планшеты (Millipore, США), предварительно покрытые захватывающим антителом к IFNγ (BD Biosciences, США). Затем клетки культивировали в течение 48 часов (37 ° C, 5% CO ₂) в присутствии или в отсутствие пептидов, производных от NS1 (100 нг каждого пептида на лунку). После стимуляции планшеты промывали (3 × PBS и 5 × PBS-T) и окрашивали (2 ч при комнатной температуре) биотинилированным мышиным mAb против IFNγ (BD Biosciences, США) в концентрации 2 мкг / мл.После отмывки планшеты инкубировали со стрептавидином, меченным пероксидазой (Sigma, США), в течение 2 ч при комнатной температуре. Планшеты снова промывали и проявляли субстратом TrueBlue ™ (KPL, Милфорд, Массачусетс, США) в течение 20 минут при комнатной температуре. Пятна подсчитывали и выражали как клетки, продуцирующие IFNγ / 10 ⁶ спленоцитов.

Смертельный вызов с ЗИКВ

^BR

Через две недели после введения второй дозы вакцины иммунизированных мышей AB6 внутривенно вводили. заражены 10 ⁶ БОЕ ЗИКВ ^БР.За животными наблюдали до 15 дней на предмет появления клинических признаков в соответствии с произвольной шкалой (здоровые — 0 баллов; взъерошенный мех — 1 балл; паралич — 2 балла; деформированный позвоночник — 3 балла; умирающие — 4 балла). , измерение массы тела и смертности. Образцы сыворотки собирали через день и хранили при -80 ° C для анализа вирусемии.

Титрование вируса

Число инфекционных частиц ZIKV определяли с помощью анализа бляшек. Вкратце, 10-кратные серийные разведения образцов вируса готовили в среде MEM, которые добавляли к монослоям клеток Vero, предварительно созданным в 24-луночных планшетах (Corning), и инкубировали в течение 1 ч при 37 ° C.После инкубации клеточные супернатанты удаляли аспирацией, к клеткам добавляли верхний раствор, содержащий MEM плюс карбоксиметилцеллюлозу (1%) и SFB (2%), и инкубировали (37 ° C, 5% CO ₂) в течение 4 дней. . Монослои клеток фиксировали формальдегидом (4%), разведенным в PBS, в течение 15 мин (RT). После промывки водой клетки окрашивали 1% раствором кристаллов фиолетового цвета (Laborclin) в течение 10 мин (RT). Подсчитывали планшеты для вирусного лизиса и выражали в единицах бляшек на мл (БОЕ / мл).

Статистический анализ

Статистический анализ выполняли с использованием программного обеспечения Prism 6 (GraphPad Software Inc, LA Jolla, CA). T -тест использовался для сравнения только двух групп. Односторонний дисперсионный анализ был применен с апостериорным тестом Бонферрони для сравнения результатов с участием нескольких (≥3) групп. Двусторонний дисперсионный анализ с последующей коррекцией Бонферрони использовался, когда данные включали несколько групп и более одной переменной (временные точки). Лог-ранговый тест (Mantel-Cox) использовался для анализа данных о выживаемости и заболеваемости.Различия считались значимыми, когда значение p (p) было ≤0,05.

Результаты

ДНК-векторы, кодирующие белок ZIKV NS1

Были сконструированы две плазмиды, кодирующие полноразмерный белок NS1 ZIKV, либо изолированные (pNS1-ZIKV) (рис. 1A), либо генетически слитые с белком gD HSV-1 (pgDNS1-ZIKV) (рис. 1B). Плазмиды подвергали рестрикционному анализу с использованием BglII и PstI , и высвободившиеся фрагменты имели ожидаемую электрофоретическую подвижность (NS1–1,056 pb; gDNS1–2,262 pb) (дополнительный рисунок 1).Экспрессия кодируемых белков в клетках HEK 293, трансфицированных pNS1-ZIKV или pgDNS1-ZIKV, была подтверждена NS1-специфическими антителами с помощью проточной цитометрии и иммунофлуоресценции (Фигуры 1C, E). Интересно, что клетки, трансфицированные pgDNS1-ZIKV, показали повышенную экспрессию ZIKV NS1 по отношению к клеткам, трансфицированным pNS1-ZIKV (фигура 1D). Экспрессия gD HSV-1 в клетках, трансфицированных pgDNS1-ZIKV, также была подтверждена иммунным блоттингом (дополнительная фигура 2). Взятые вместе, эти результаты демонстрируют, что рекомбинантные белки, кодируемые ДНК-вакцинами, должным образом экспрессировались в клетках млекопитающих.

Слияние ZIKV NS1 с gD HSV-1 усиливает индуцированные гуморальные и клеточные иммунные ответы

Затем мы оценили иммуногенность ДНК-вакцин у мышей C57BL / 6 дикого типа (WT). Животных иммунизировали двумя внутримышечно. дозы путем электропорации (рис. 2А). Как показано на фиг. 2В, аналогичные титры сывороточного NS1-специфического IgG были обнаружены через 14 дней после введения второй дозы вакцины у мышей, иммунизированных pNS1-ZIKV или pgDNS1-ZIKV. Анализ NS1-специфических сывороточных ответов подкласса IgG показал, что вакцинированные мыши вызвали аналогичные ответы подклассов IgG1 и IgG2c (фигура 2D).Мы также исследовали связывание объединенных образцов сыворотки против NS1 с нативным NS1, экспрессируемым в ZIKV-инфицированных клетках Vero. Как показано на фиг. 2С и дополнительной фиг. 3, антитела против NS1, полученные у мышей, иммунизированных pgDNS1-ZIKV, показали более высокую активность связывания клеток в отношении образцов сыворотки, собранных у мышей, иммунизированных pNS1-ZIKV. Как и ожидалось, мыши, иммунизированные вектором pUMVC3, не вызывали ответов антител против NS1 (Фигуры 2B, C).

Рисунок 2 .Иммунные ответы, вызванные у вакцинированных иммунокомпетентных мышей. (A) Схематическое изображение схемы вакцинации. Мыши C57BL / 6 находились внутримышечно. иммунизировали двумя дозами (50 мкг / животное) ДНК-вакцин, вводимых с помощью электропорации. Образцы сыворотки собирали через 14 дней после введения каждой дозы вакцины, а специфические Т-клеточные ответы измеряли через 2 недели после последней дозы вакцины с помощью ELISpot. (B) Профили зависимости реакции от дозы IgG к NS1, измеренные с помощью ELISA с отдельными образцами сыворотки, собранными у вакцинированных мышей (pUMVC3 и NS1-ZIKV, n = 21 / каждая группа; pgDNS1-ZIKV, n = 23) .Данные выражены в виде средних значений (столбцы) и индивидуальных (символы) титров IgG (Log10), полученных в трех независимых экспериментах. (C) Связывание сывороточных антител против NS1 с нативным белком NS1 ZIKV. Разбавленные объединенные образцы сыворотки, собранные у вакцинированных мышей ( n = 10), подвергали реакции с инфицированными ZIKV клетками VERO и анализировали с помощью проточной цитометрии. MAb 4h3 (специфичное для NS1) использовали в качестве контроля. (D) Ответы подкласса IgG, измеренные через 14 дней после введения второй дозы вакцины в индивидуальных образцах сыворотки от иммунизированных мышей ( n = 10).Отношения IgG1 / IgG2c указаны в верхней части рисунка. Статистическая значимость рассчитывалась с использованием двух / одностороннего дисперсионного анализа с поправкой Бонферрони. T -тест был использован для анализа ответов подкласса IgG (* p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001, NS = незначительный).

Было показано, что слияние антигенов с gD ВПГ-1 усиливает клеточный иммунный ответ на антигены-пассажиры у вакцинированных мышей (40, 46–48).Таким образом, мы также оценили антиген-специфические клеточные ответы, индуцированные у мышей, иммунизированных составами вакцины. Для этой цели in silico. предсказанные MHC-I рестриктирующие пептиды ZIKV NS1 были проверены на спленоцитах мышей, инфицированных ZIKV (дополнительная фигура 4). Прогнозирование пептидов было выполнено с использованием C-концевой области белка NS1 на основании недавнего отчета, описывающего присутствие иммунодоминантных эпитопов CD8 + Т-клеток у мышей (23). Более того, чтобы максимизировать обнаружение NS1-специфических Т-клеток, иммунизированных мышей инфицировали ZIKV, и через 3 дня определяли количество клеток, продуцирующих IFNγ.Это обоснование было основано на предыдущих доказательствах, демонстрирующих, что распространение антиген-специфических CD8 ⁺ Т-клеток может быть доступно в этот момент времени после вирусной инфекции (16). Таким образом, выбранные пептиды (дополнительная таблица 1) применяли в анализах IFNγ-ELISPOT, проводимых со спленоцитами, собранными с 3 d.p.i от иммунизированных мышей (фигура 2A). Как показано на фиг. 3, только мыши, иммунизированные pgDNS1-ZIKV, вызвали статистически значимое увеличение количества секретирующих IFN-γ клеток селезенки после стимуляции in vitro двумя разными пептидами, ограниченными MHC-I.Взятые вместе, эти результаты показывают, что иммунизация pgDNS1-ZIKV одновременно улучшает NS1-специфический ответ IgG и ответы Т-клеток.

Рисунок 3 . Анализ клеточных иммунных ответов у вакцинированных иммунокомпетентных мышей. Иммунизированных мышей ( n = 10) инфицировали ZIKV ^BR и собирали спленоциты 3 d.p.i. Выделенные клетки стимулировали in vitro пептидами ZIKV NS1 и анализировали в отношении продукции цитокинов с помощью IFNγ-ELISpot.Данные представлены в виде среднего значения ± SEM (столбцы) или отдельных (символы) количества пятен. Статистическая значимость рассчитывалась с использованием двустороннего дисперсионного анализа с поправкой Бонферрони (*** p <0,001, **** p <0,0001).

ZIKV-инфицированные иммунодефицитные мыши показали снижение виремии после иммунизации ДНК-вакцинами, кодирующими NS1

Поскольку мыши дикого типа не восприимчивы к ZIKV, мы протестировали защитный иммунитет, индуцированный ДНК-вакцинами, кодирующими NS1, на линии мышей AB6, дефицитной по экспрессии рецептора IFN типа I (IFNAR1 — / -) (56, 57) .Мышей AB6 иммунизировали по той же схеме 2 внутримышечно. дозы с интервалом 2 недели, и через 2 недели после последней дозы животных заражали внутривенным введением. прививка 10 ⁶ БОЕ ЗИКВ ^БР (рисунок 4А). Перед заражением вирусом у мышей, иммунизированных pgDNS1-ZIKV, были обнаружены более высокие сывороточные антитела IgG к NS1 по сравнению с мышами, иммунизированными pNS1-ZIKV (фиг. 4B). Примечательно, что мыши, иммунизированные pNS1-ZIKV или pgDNS1-ZIKV, показали преобладающие ответы подкласса IgG2c (отношения IgG1 / IgG2c равны 0.074 и 0,161 соответственно) (Рисунок 4C). Виремию наблюдали у вакцинированных и зараженных мышей до 7 дней. Как показано на фигурах 4D-F, мыши, иммунизированные ДНК-вакцинами, кодирующими NS1, показали снижение виремии по сравнению с мышами, иммунизированными группой pUMVC3. Точно так же мыши, иммунизированные pNS1-ZIKV или pgDNS1-ZIKV, показали более короткий период виремии (фигуры 4D – F). Эти результаты ясно демонстрируют, что иммунизация ДНК-вакцинами, кодирующими ZIKV NS1, оказывает прямое влияние на продолжительность периода и интенсивность виремического состояния, как измерено у вакцинированных мышей AB6.

Рисунок 4 . Иммунные ответы и защитный иммунитет, индуцированные ДНК-вакцинами у мышей с иммунодефицитом. (A) Схематическое изображение схемы вакцинации. Мышей AB6 иммунизировали дважды внутримышечно. маршрут в сочетании с электропорацией. Образцы сыворотки собирали через 14 дней после каждой дозы вакцины. Мыши были в / в. инфицировали 10 ⁶ БОЕ ZIKV ^BR через 2 недели после последней дозы вакцины и наблюдали за вирусом, заболеваемостью и смертностью в течение 15 дней.Ответы против NS1 подкласса (B) Total и (C) подкласса IgG измеряли с помощью ELISA с образцами сыворотки, собранными у иммунизированных мышей ( n = 9). Данные были получены из трех независимых экспериментов и выражены в виде среднего (столбцы) ± SEM или отдельных значений (символы) титров антител (Log10). Отношения IgG1 и IgG2c указаны в верхней части рисунка. (D – F) Через 2 недели после последней дозы иммунизированных мышей ( n = 5) вводили в / в. заражен ZIKV (10 ⁶ БОЕ / животное).Виремия выражается в виде среднего значения ± стандартное отклонение БОЕ / мл, измеренного индивидуально до седьмого дня после заражения. Результаты представляют три независимых эксперимента. Статистическая значимость рассчитывалась с использованием двух / одностороннего дисперсионного анализа с поправкой Бонферрони. Тест T был использован для анализа результатов подкласса IgG (* p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, NS = не значимо).

Иммунизация pgDNS1-ZIKV повысила защитный иммунитет против ZIKV у мышей AB6

Иммунизированных мышей AB6 контролировали на предмет индуцированной вакциной защиты от ZIKV-индуцированной заболеваемости и смертности.Используя классификацию шкалы симптомов, мыши, иммунизированные pgDNS1-ZIKV, показали меньшую заболеваемость по сравнению с невакцинированными мышами, чем животные, иммунизированные pNS1-ZIKV (фигуры 5A – D). Мыши, вакцинированные pgDNS1-ZIKV, восстанавливали массу тела через ~ 10 дней после заражения, в то время как мыши, иммунизированные pNS1-ZIKV, восстанавливали свою массу тела через 2 недели после заражения (фиг. 5E). Мы также измерили индуцированную вакциной защиту против ZIKV у мышей AB6, зараженных летальным в / в. доза вируса. Как показано на фиг. 5F, иммунизация pgDNS1-ZIKV обеспечивала более высокую выживаемость (46%) при летальной инфекции ZIKV по сравнению с мышами, иммунизированными pNS1-ZIKV (27%).У мышей, иммунизированных контрольным вектором, защиты не наблюдалось. Взятые вместе, эти результаты показали, что ДНК-вакцины, кодирующие ZIKV NS1, обеспечивают частичную защиту от инфекции ZIKV у иммунодефицитных мышей AB6. Кроме того, настоящие результаты продемонстрировали, что генетическое слияние NS1 с белком gD улучшает индукцию антиген-специфических иммунных ответов и защитный иммунитет к ZIKV.

Рисунок 5 . Защитный иммунитет, индуцированный ДНК-вакцинами, кодирующими ZIKV NS1.Мышей AB6 иммунизировали pUMVC3 ( n = 12) (A) , pNS1-ZIKV ( n = 11) (B) или pgDNS1-ZIKV ( n = 13) (C) и контролировались ежедневно в течение 15 дней после заражения ZIKV. Результаты представлены как процент животных, классифицированных по клиническому состоянию (здоровый, взъерошенный мех, паралич, умирающий или мертвый), в цветовой шкале, как показано на рисунке. Клиническая оценка (D) , изменение массы тела (E) и профили смертности (F) были оценены у зараженных животных.Данные представляют собой результаты трех независимых экспериментов и представлены как средние значения ± стандартная ошибка среднего процентного соотношения соответствующих параметров в различных группах иммунизации. Статистическую значимость оценивали с помощью двустороннего дисперсионного анализа с поправкой Бонферрони. Для анализа результатов выживаемости использовали тест Мантела-Кокса. (* p <0,001).

Обсуждение

Последние достижения демонстрируют, что как клеточные, так и гуморальные иммунные ответы играют важную роль в развитии защитного иммунитета к флавивирусу в экспериментальных и клинических условиях.Следовательно, идеальные вакцины от заболеваний, связанных с инфекциями DENV и ZIKV, должны предпочтительно активировать обе ветви иммунной системы (19, 58, 59). Здесь мы описываем использование новой стратегии ДНК-вакцины, основанной на экспрессии ZIKV NS1, либо отдельно, либо генетически слитого с белком gD HSV-1, в качестве подхода к оценке защитной роли специфических иммунных ответов к NS1 в экспериментальных условиях. условия. Результаты ясно продемонстрировали, что иммунизация ДНК-вакцинами, кодирующими NS1, индуцирует NS1-специфические иммунные ответы у иммунокомпетентных и иммунодефицитных мышей, приводя к частичной защите от летального системного заражения ZIKV у иммунодефицитных мышей AB6.Использование электропорации в качестве средства доставки ДНК-вакцин привело к аналогичным титрам сывороточного анти-NS1 IgG у мышей, иммунизированных pgDNS1-ZIKV или pNS1-ZIKV. Тем не менее, слияние ZIKV NS1 с gD усиливает связывание антител с нативным антигеном NS1, экспрессируемым в инфицированных клетках млекопитающих. Более того, используя спленоциты от мышей, вакцинированных pgDNS1-ZIKV, мы обнаружили большее количество клеток, секретирующих IFN-γ, после стимуляции in vitro пептидами, производными от NS1, ограниченными MHC-I. Более того, иммунизация мышей с иммунодефицитом ДНК-вакциной, кодирующей gD-NS1, снижала с большей эффективностью показатели заболеваемости и смертности, обнаруживаемые после заражения ZIKV.В совокупности эти результаты подтверждают использование генетического слияния антигенов с gD HSV-1 в качестве многообещающей платформы для разработки стратегий вакцинации ZIKV и подтверждают адъювантные эффекты белка gD на иммунные ответы, индуцированные ДНК-вакцинами на основе ZIKV NS1.

Потенциал NS1 в качестве антигена-мишени был исследован в отношении индукции как гуморальных, так и клеточных иммунных ответов (23, 35, 37, 60). Этот белок нацелен на циркулирующие антитела против NS1 либо в плазме в виде гексамеров, либо на цитоплазматической мембране инфицированных клеток в виде димеров, что может приводить к лизису клеток (38).Поскольку белок NS1 не присутствует на вирусной частице, антитела против NS1 не способны вызывать феномен ADE (36, 38, 39, 61). Хотя антитела против DENV-NS1 связаны с побочными эффектами, связанными с перекрестной реактивностью с белками хозяина (62–64), такие эффекты, по-видимому, являются вирус-специфичными, поскольку не сообщалось об аналогичных эффектах с антивирусом вируса японского энцефалита (JEV) -NS1 антитела (64). Более того, существуют противоречивые данные о защитных и вредных эффектах, связанных с NS1-специфическими антителами при инфекциях DENV и ZIKV (65, 66).С другой стороны, пассивная иммунизация мышей поликлональными или моноклональными антителами против NS1 способствовала явному защитному эффекту от вирусной инфекции (36, 38, 39). Недавно был модифицирован вирус осповакцины анкары (MVA) для экспрессии ZIKV NS1-индуцированной защиты после внутричерепного заражения путем индукции NS1-специфических IgG2a и полифункциональных NS1-специфичных CD8 ⁺ Т-клеток (35, 37). Было также обнаружено, что человеческие mAb против NS1 обеспечивают частичную защиту иммунодефицитных мышей, зараженных ZIKV, посредством пассивного иммунитета (38, 39).Кроме того, опосредованный Т-клетками иммунитет играет важную роль в защите, индуцированной ДНК-вакцинами на основе NS1, против инфекции ZIKV (23). Таким образом, сильная индукция антител против NS1, связанная с активацией Т-клеточных ответов, представляет собой ключевые особенности вакцины на основе NS1, способной генерировать защитный иммунитет к ZIKV.

Защитная роль антител против NS1 коррелировала с активностью связывания с поверхностно-ассоциированным NS1 в ZIKV-инфицированных клетках, что способствует выведению инфицированных клеток за счет цитотоксичности ADCC или FcR-опосредованного комплемента (FC) (36–39 ).Наши данные показывают, что, хотя аналогичные сывороточные ответы против NS1 IgG были индуцированы тестируемыми ДНК-вакцинами на основе NS1 у иммунокомпетентных мышей, мыши, вакцинированные pgDNS1-ZIKV, вырабатывали антитела против NS1 с более высокой клеточной связывающей активностью по сравнению с теми, которые иммунизированы pNS1-ZIKV. . Поскольку эти антитела способны распознавать ассоциированные с мембраной димеры NS1 в ZIKV-инфицированных клетках, мы ожидаем, что в условиях in vivo это будет способствовать удалению инфицированных клеток. Наличие более высоких уровней IgG2c у мышей AB6, иммунизированных pgDNS1-ZIKV, также подтверждает эту гипотезу, поскольку известно, что антитела IgG2c прочно связываются с ADCC-медиатором FcyRIV (67, 68).Таким образом, усиленный иммунитет, наблюдаемый в этой группе, может быть связан с ролью gD в модуляции индуцированных антиген-специфических ответов. Более того, трансфекция клеток pgDNS1-ZIKV увеличивает экспрессию in vitro NS1 по сравнению с клетками, трансфицированными pNS1-ZIKV, характеристика, которая также может влиять на иммуногенность кодируемых белков. Эти результаты подчеркивают адъювантные эффекты gD на иммуногенность антигенов, кодируемых ДНК-вакцинами.

Роль Т-клеток в борьбе с инфекцией ZIKV подчеркивалась в различных исследованиях.Этот тип иммунного ответа недавно был связан с защитой от заражения ZIKV в экспериментальных условиях, а также в контексте защиты от вторичных гетерологичных флавивирусных инфекций (58, 69, 70). Более того, опосредованные Т-клетками иммунные ответы, индуцированные NS1-вакцинацией, были описаны как ключевой элемент в контроле инфекций ZIKV в доклинических условиях (23, 37). Аналогичные результаты были также получены в клинических исследованиях, демонстрирующих, что NS1 способен индуцировать устойчивую продукцию IFN-γ Т-клетками во время инфекции ZIKV (71, 72).Поскольку платформа слияния антигена gD широко изучалась для увеличения опосредованных Т-клетками защитных иммунных ответов (40, 41, 46–48), здесь мы проверили, приведет ли такой подход к усилению NS1-специфического IFN в другом контексте вакцины. -γ продуцирующие Т-клетки. Используя MHC-I рестриктирующие пептиды ZIKV NS1 для активации in vitro клеток селезенки иммунокомпетентных мышей, иммунизированных C57BL / 6, мы наблюдали, что только экспрессия NS1, слитого с белком gD, способствует значительному усилению клеточных ответов, секретирующих IFN-γ.Поскольку мы использовали пептиды рестрикции MHC-I для стимуляции клеток in vitro , эти результаты также предполагают активацию Т-клеточных ответов CD8 ⁺ у вакцинированных мышей и открывают перспективы использования идентифицированных пептидов, ограниченных MHC-I, в будущем. исследования, посвященные индукции NS1-специфических Т-клеточных ответов в экспериментальных условиях. Взятые вместе, эти результаты показали, что стратегия слияния gD является многообещающей альтернативой для усиления NS1-специфического клеточного ответа, индуцированного вакцинацией.

Наши данные также подтверждаются недавним исследованием, в котором сообщалось об использовании ДНК-вакцин, кодирующих белок ZIKV NS1 (23). Несмотря на различия в тестируемой схеме вакцинации, включая количество доз (всего три), путь иммунизации (внутрикожный) и генетический фон мыши (BALB / c), только экспрессия модифицированной формы NS1 (pVAX-tpaNS1) была способна вызвать индуцируют высокие титры антител, способных распознавать NS1 на инфицированных клетках, и значительную активацию ответов Т-клеток. Более того, авторы сообщили о наличии иммунодоминантных Т-клеточных эпитопов CD4 ⁺ и CD8 ⁺ в С-концевой области NS1 (аминокислотные остатки от 172 до 352) (23).Точно так же эпитопы, ограниченные MHC-I, предсказанные и подтвержденные в нашей работе, картированы в одной и той же области белка. Кроме того, генетическое слияние с белком gD HSV-1 привело к усиленной активации NS1-специфичных клеток, секретирующих IFN-γ, у вакцинированных мышей. Различия в эпитопах Т-клеток CD8 ⁺, использованных в двух исследованиях, отражают различные генетические фоны тестируемых линий вакцинированных мышей (BALB / c × C57BL / 6). С другой стороны, поскольку валидация пептидов, описанных в нашем исследовании, была проведена после заражения ZIKV, эти результаты могут отражать часть репертуара иммунодоминантных эпитопов, обнаруженных в более естественных условиях.Тем не менее, поскольку мы не оценивали индуцированные иммунные ответы с полноразмерным NS1, другие эпитопы также могут быть нацелены после иммунизации pgDNS1-ZIKV. Аналогичным образом, дальнейшие исследования должны быть направлены на изучение положительного влияния слияния антигена gD на индукцию NS1-специфических Т-клеточных ответов CD4 ⁺.

Мыши дикого типа (WT), такие как C57BL / 6, сохранили ответы IFN типа I, которые обеспечивают защиту от инфекций флавивирусов и, следовательно, не допускают эффективной репликации вируса, возникновения эффектов заболеваемости и летальности, связанных с инфекцией ZIKV (73, 74).Чтобы оценить защитную способность тестируемых здесь составов, мы использовали линию мышей с дефицитом рецептора IFN типа I (IFNAR1 — / -), которая восприимчива к инфекции ZIKV (57). Применяя тот же протокол вакцинации, мы обнаружили более высокие титры сывороточных анти-NS1 IgG у мышей, иммунизированных pgDNS1-ZIKV, по сравнению с мышами, иммунизированными pNS1-ZIKV. После заражения мыши, вакцинированные pgDNS1-ZIKV, показали снижение показателей заболеваемости и летальности по сравнению с животными, иммунизированными pNS1-ZIKV. Кроме того, обе ДНК-вакцины на основе NS1 индуцировали преобладающий ответ подкласса сывороточного IgG2c и снижали виремию после инфицирования.Взятые вместе, эти наблюдения подтверждают адъювантные эффекты стратегии слияния gD, применяемые к ДНК-вакцинам, что приводит к усилению NS1-специфических гуморальных и клеточных иммунных ответов у иммунокомпетентных мышей и защитного иммунитета у мышей AB6. Наблюдаемые NS1-опосредованные защитные профили согласуются с предыдущими исследованиями, посвященными ZIKV NS1 на иммунодефицитных мышах (35), а также на иммунокомпетентных мышах BALB / c (23, 60) или CD-1 / ICR (37). Более того, в отличие от результатов, описанных в исследовании с использованием ДНК-вакцины на основе NS1 (23), наши составы были способны обеспечивать защиту у мышей IFNAR1 ^{— / —} даже после заражения высокой дозой инфекции (10 ⁶ БОЕ ).

Несмотря на преимущества ДНК-вакцин по сравнению с другими подходами к вакцинам, которые включают производство и стоимость, ДНК-вакцины обычно демонстрируют пониженную иммуногенность при тестировании в клинических условиях (75). Электропорация представляет собой одну из наиболее эффективных стратегий повышения иммуногенности ДНК-вакцин как у мышей, так и у людей (76). Предыдущие данные продемонстрировали, что электропорация усиливает активацию опосредованных Т-клетками защитных ответов на модели заражения опухолью мышей (77).В настоящем исследовании введение ДНК-вакцин посредством электропорации способствовало индукции иммунных ответов с уменьшением доз вакцины, вводимых животным, по сравнению с другим исследованием, основанным на ДНК-вакцине, кодирующей ZIKV NS1 (23). В целом, настоящие доказательства дополнительно подтверждают актуальность электропорации как предпочтительного метода доставки для введения ДНК-вакцин в экспериментальных или клинических условиях.

Хотя адъювантная роль gD очевидна во всех стратегиях, исследованных до сих пор, механизмы, связанные с наблюдаемыми адъювантными эффектами, остаются полностью не выясненными.Иммуномодулирующие эффекты gD в основном основаны на способности связывания со специфическими рецепторами, расположенными на поверхности антигенпрезентирующих клеток, такими как рецептор HVEM в дендритных клетках (DC) (48). Связывание gD препятствует взаимодействию HVEM с его природными иммуносупрессивными лигандами, что приводит к окончательному усилению активации В- и Т-клеток (48). Связывание gD с HVEM также запускает активацию пути NF-каппа B, способствующего сигналам про выживания в Т-клетках (44, 45, 78). Кроме того, как описано ранее, очищенные химерные белки на основе gD способны активировать субпопуляцию DC, специализирующуюся на перекрестной презентации антигена, и приводить к усилению генерации активированных антиген-специфичных Т-лимфоцитов CD8 ⁺ (41).Эти эффекты согласуются с результатами, представленными здесь, в которых образование химерного белка NS1 / gD способствовало усиленным NS1-специфическим клеточным ответам.

В целом, результаты, представленные здесь, впервые описывают стратегию, основанную на использовании ДНК-вакцин, кодирующих ZIKV NS1, генетически слитых с белком gD HSV-1. Адъювантные эффекты, наблюдаемые с химерным NS1 / gD в отношении индукции NS1-специфических клеточных и гуморальных иммунных ответов, поддерживают использование такого подхода в дальнейших попытках повысить иммунитет к ZIKV, индуцированному ДНК-вакцинами, и открывают перспективы для разработки эффективных антибиотиков. -ЗИКВ вакцины, а также другие флавирусы.

Заявление о доступности данных

Оригинальные материалы, представленные в исследовании, включены в статью / дополнительные материалы, дальнейшие запросы можно направить соответствующему автору.

Заявление об этике

Исследование на животных было рассмотрено и одобрено Комитетом по уходу и использованию животных (CEUA) Университета Сан-Паулу (номер протокола 96/2016).

Авторские взносы

LP и LF: задумал и разработал эксперименты.LP, RA, NS, RA-S, AV-C, SP, MC-A, MR-J, MF и RC-C: проводили эксперименты. LP и RA: проанализировали данные. MR-J и LM: предоставленные реагенты, материалы и инструменты анализа. Л.П .: подготовил цифры. LP, RA, RA-S, MC-A и LF: написали статью. NS, AV-C, SP, MR-J и MF: рукопись исправлена. Все авторы прочитали и одобрили окончательную версию рукописи.

Финансирование

Эта работа была поддержана Фондом ампаро-а-Пескиса-ду-Эстадо-де-Сан-Паулу (FAPESP) и Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).Номера грантов FAPESP: 2016 / 20045-7 (LF), 2016 / 05570-8 (LP), 2014 / 17595-0 (RA), 2016 / 14344-1 (NS), 2016 / 23560-0 (RA-S) , 2017 / 09661-0 (SP), 2018 / 14459-9 (MC-A) и 2018 / 08199-4 (MF). Номера грантов CAPES: 88887.473724 / 2020-00 (AV-C) и 88887.185337 / 2018-00 (MR-J).

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Авторы выражают благодарность Эдуардо Гименесу Мартинсу за неоценимую техническую поддержку.Мы также поблагодарили доктора Роксану Марию Фонтес Пьяццу (Институт Бутантана, Бразилия) за пожертвование mAb 4h3.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmedt.2020.604160/full#supplementary-material

Ссылки

1. Фэй О, Фрейре СКК, Ямарино А., Фэй О, де Оливейра Дж.В.К., Диалло М. и др. Молекулярная эволюция вируса Зика во время его появления в 20 веке. PLoS Negl Trop Dis . (2014) 8:36. DOI: 10.1371 / journal.pntd.0002636