Бассейн на паршина: Бассейн Октябрь (Фитнес клуб Энигма)

Вклад авторов

Концептуализация, А.Г.З. и N.Y.M .; методология, N.Y.M., E.A.P. и A.G.Z .; расследование, E.A.P., N.Y.M., and A.G.Z .; написание оригинального черновика, N.Y.M. и E.A.P .; написание рецензии и редактирование, N.Y.M. и A.G.Z .; привлечение финансирования, A.G.Z. и N.Y.M.

Декларация интересов

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов

Ссылки

• Го К., Сюэ Я., Ян Г., Инь С., Ши В., Ченг Й., Янь Х., Фань С. , Zhang H., Zeng F. Nanog РНК-связывающие белки YBX1 и ILF3 влияют на плюрипотентность эмбриональных стволовых клеток.Cell Biol. Int. 2016; 40: 847–860. DOI: 10.1002 / cbin.10539. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Кин Дж. Д., Комисаров Дж. М., Фридерсдорф М. Б. RIP-Chip: выделение и идентификация мРНК, микроРНК и белковых компонентов рибонуклеопротеиновых комплексов из клеточных экстрактов. Nat. Protoc. 2006; 1: 302–307. [PubMed] [Google Scholar]
• Мартынова Н.Ю., Ерошкин Ф.М., Ермолина Л.В., Ермакова Г.В., Коротаева А.Л., Смурова К.М., Гёева Ф.К., Зарайский А.Г. передняя нервная пластинка эмбриона Xenopus laevis.Dev Dyn. 2008; 237: 736–749. [PubMed] [Google Scholar]
• Мартынова Н.Ю., Паршина Е.А., Зарайский А.Г. Протокол разделения ядерной и цитоплазматической фракций эмбриональных клеток Xenopus laevis для изучения челночного перемещения белков. Протоколы STAR. 2021; 2: 100449. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Мац М., Фрадков А., Лабас Ю., Савицкий А., Зарайский А., Маркелов М., Лукьянов С. Флуоресцентные белки небиолюминесцентных видов Anthozoa. Nat. Biotechnol. 1999; 17: 969–973.DOI: 10,1038 / 13657. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Nieuwkoop P.D., Faber J. Garland Science; 1994. Нормальная таблица Xenopus laevis (Daudin): систематический и хронологический обзор развития от оплодотворенного яйца до конца метаморфоза. [Google Scholar]
• Паршина Е.А., Ерошкин Ф.М., Орлов Э.Е., Гёева Ф.К., Шохина А.Г., Староверов Д.Б., Белоусов В.В., Жигалова Н.А., Прохорчук Э.Б., Зарайский А.Г. Цитоскелетный белок эмбрионального статуса, отвечающий за активность эндокринного клеточного стебля Zytoskeletin.Cell Rep.2020; 33: 108396. [PubMed] [Google Scholar]
• Сиве Х.Л., Грейнджер Р.М., Ричард Р.М. Лабораторный пресс Колд-Спринг-Харбор; 2002. Раннее развитие Xenopus laevis: лабораторное руководство. [Google Scholar]

X. Кубок мира CMAS по плаванию в финском бассейне 2015 г.

Клинический контроль переливания эритроцитов при острой хирургической патологии, такой как расширение желудка и заворот желудка у собак

Ватников Ю.А., Сахно Н.В., Сотникова Е.Д., Сотникова Е.Д., Куликов Е.В., Паршина В.И., Трошина Н.И. Клинический контроль переливания упакованных эритроцитов при острой хирургической патологии, такой как расширение желудка и заворот желудка. Собаки. Biomed Pharmacol J 2015; 8 (2)

Рукопись получена:
Рукопись принята:
Опубликована онлайн: 01.08.2016

Юрий Анатольевич Ватников ¹ , Николай Владимирович Сахно ² , Елена Дмитриевна Сотникова ¹ и Елена Дмитриевна Сотникова ¹ , Евгений Владимирович Куликовна 1 ^{Наталья} и Куликовна ¹ Наталья Наталья

¹ Российский университет дружбы народов Россия, 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, 6 ² Орловский государственный аграрный университет Россия, 302019, г. Орел, ул. Ген. Родина, 69

DOI: https://dx.doi.org/10.13005/bpj/817

Аннотация

Основной целью данной работы был анализ периферической крови при хирургической патологии у собак с расширением желудка и заворотом желудка, а также коррекция послеоперационного состояния путем переливания эритроцитов. Методологической основой исследования послужили научные материалы отечественных и зарубежных авторов, повлиявшие на использование переливания крови и контроль различных видов коррекции при угрожающих жизни состояниях.В исследованиях использованы методы клинического обследования, характеризующие патогенетические аспекты изучаемой проблемы. В период послеоперационного наблюдения за животными выявлялась анемия на 1-7 сутки, тромбоцитопения на 1-3 сутки, а также выраженная иммуносупрессия, вызванная развитием анестезии и спленэктомии, что подтверждалось лимфопенией и тромбоцитопенией на сутки. 1-3. Исследование показало, что использование упакованных эритроцитов в раннем послеоперационном периоде снижает тяжесть анемии и тяжесть воспалительного процесса.Введение донорских эритроцитов снижает иммуносупрессивный эффект спленэктомии и эффекты общей анестезии, запускает продукцию тромбоцитов, ретикулоцитов, тем самым стимулируя пролиферацию клеток для репаративных процессов. Использование упакованных эритроцитов при тяжелой патологии брюшной полости у собак в послеоперационном периоде является перспективным направлением развития гемотрансфузии в ветеринарной хирургии.

Ключевые слова

собаки; расширение желудка и заворот желудка; гемограмма; инфузионная терапия; упакованные эритроциты; исправление; послеоперационный период

Введение

Хирургическая патология брюшной полости, связанная с расширением желудка и заворотом желудка у собак, представляет собой сложный разнонаправленный, трудно поддающийся лечению патологический процесс. Его анализ с учетом гибели собак в различные сроки после операции (Недобежкова, Ватников, 2013; Боженова, 2013) показал, что при расширении желудка и завороте желудка в течение 4-6 часов 75% случаев были связаны с серьезными осложнениями, в то время как в 25% случаев умерло животное.Если расширение желудка и заворот желудка длится 6-8 часов, в 100% случаев наблюдаются какие-то осложнения, а смертность составляет 50%. Эти осложнения вызывают большой интерес в ветеринарной практике (Fossum, Hetlund, 2002; Ватников, 2009; Hall et al., 2010; Позябин, 2013; Недобежкова и др., 2013; Goleva, Vatnikov, 2014; Mooney et al. , 2014), поскольку на сегодняшний день недостаточно данных о мероприятиях, гарантирующих клинический контроль патологических процессов в послеоперационном периоде при дилатации желудка и завороте желудка.

Цель исследования

Анализ периферической крови при хирургической патологии, вызванной дилатацией и заворотом желудка, и коррекция послеоперационного состояния переливанием эритроцитов в пакетиках.

Материалы и методы

Использованы результаты исследований периферической крови собак крупных и гигантских пород (n = 28), допущенных к лечению с диагнозом дилатация желудка и заворот желудка, в промежутках времени от 4 до 8 часов от начала заболевания.Хирургическая операция у всех животных сочеталась со спленэктомией.

Собаки были разделены на две группы: 1-я группа (n = 12) животных получала стандартную терапию: раствор Локка-Рингера вводили парентерально в дозе 50-90 мл на кг массы тела в сутки, полиглюцин в дозе 10 мл на кг массы тела в сутки при высокой кровопотере, Реополиглюцин в дозе 10 мл на кг массы тела в сутки, 10% раствор глюкозы в дозе 10 мл на кг массы тела в сутки, 5% раствор аскорбиновой кислоты в дозе 2 мл на животное, b.i.d., Гамавит 4 мл на животное 1 раз в день, Кокарбоксилаза в дозе 0,05 г на животное в день 1 раз в день, 10% раствор сульфокамфокаина 0,2 г на животное в день 1 раз в день, Зантак 50 мг на животное 2 раза в день; перорально: Альмагель А — 5 мл на животное три раза в день. на 5 дней.

Животные группы 2 получали стандартную терапию (описанную выше) с добавлением упакованных эритроцитов в дозе 1,0 мл на 1 кг массы тела.

Исследование функционального состояния периферической крови проводили на 1, 3, 7 и 14 сутки.Методика анализа крови и общий анализ крови проводились по методике Бажибиной Е.Б., Коробова А.В. и другие. (2004). Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы MedCalc для Windows.

Результаты и обсуждение

При оценке параметров эритроцитов исследуемых образцов в сравнении с физиологическими параметрами (ФП) мы установили снижение количества эритроцитов на 27,4% (5,3 ± 0,3 ^x 10 ⁶ / мкл) , гемоглобин — на 43.21%, гематокрит — на 43,21%, а также множество изменений характеристик эритроцитов. На момент поступления в стационар индекс MCV снизился на 5,12%, что характерно для постгеморрагической анемии и возможного гемолиза (таблица 1).

Таблица 1: Изменение гемограмм у собак на фоне применения стандартной послеоперационной терапии

При этом показатели МКГ, характеризующие нормохромную анемию, находились в пределах физиологического диапазона.Средняя концентрация корпускулярного гемоглобина (MCHC) на момент поступления была в пределах физиологического диапазона и сопоставима со значениями контрольной группы. MCHC отражает степень насыщения эритроцитов гемоглобином и характеризует отношение гемоглобина к объему клетки. Это чувствительный индикатор нарушения процессов образования гемоглобина. Показатель RDW увеличился в 2,6 раза при поступлении животного. Это характеризует расширение границ разнообразия эритроцитов в кровотоке.

Количество эритроцитов в 1-е сутки после операции имело тенденцию к снижению и уменьшилось в 2,21 раза по сравнению с физиологической нормой и в 1,77 раза по сравнению с количеством эритроцитов на момент поступления животных в клинику. . Начиная с 3-го дня, динамика красных кровяных телец начинает устойчиво повышаться на 13,16%; 27,27%; 75,76% на 3, 7 и 14 дни соответственно. Однако на 14-е сутки это значение меньше физиологической нормы на 20,5%. Гемоглобин и гематокрит на 1-3 дни остаются на критически низком уровне.Это свидетельствует о тяжелой анемии, требующей немедленного восполнения пула эритроцитов.

В исследованиях на 7-е и 14-е сутки прослеживалась тенденция к нормализации гемоглобина и гематокрита. Эти параметры увеличиваются в 1,13, 1,37 и 0,8, 1,05 раза соответственно по сравнению с фоновыми значениями на момент первичного приема. Однако в тестовый период эти параметры не достигли значений контрольной группы. Несмотря на восстановление объема циркулирующей крови, известно, что анемия при кровопотере часто нарастает, поскольку уменьшение количества эритроцитов вызывается не только кровопотерей, но и повышенным их потреблением из-за гиперагрегации и разрушения ( Takahashi et al., 1983; Кучера и др., 1984; Хиггс и др., 2005; Голева и др. 2014; Пасупулети и др., 2014).

Анализ клинических данных показывает изменение некоторых характеристик эритроцитов: MCV, MCH, MCHC, RDW у животных 1-й группы. Это подтверждает выводы о возникновении возрастающей гетерогенности эритроцитов в раннем послеоперационном периоде, значимой B ₁₂ и железодефицитная анемия. Причина — наличие в селезенке запасов железа, необходимого для образования красных кровяных телец.Нарушение функции перистальтики и микрофлоры кишечника сопровождается нарушением выработки витамина B ₁₂ . При этом повышенное значение MCHC в послеоперационном периоде следует интерпретировать не погрешностями измерительного оборудования, а скорее влиянием факторов, влияющих на занижение гематокрита или завышение уровня гемоглобина (массивная в / в инфузия растворов кристаллоидов, внутрисосудистый гемолиз. , и т.д.).

Динамика изменения количества ретикулоцитов у животных 1-й группы статистически не значима.В то же время признаки тяжелой анемии, наблюдаемые у этих животных, должны вызывать ретикулоцитоз. Однако отсутствие ретикулоцитоза во время операции в этом случае можно объяснить угнетением кроветворения у животных после спленэктомии (Позябин, 2013; Голева, 2015).

На момент поступления в клинику не все значения гемограммы у собак с расширением желудка и заворотом желудка имели достоверные отличия от физиологической нормы. Тем не менее, заметно увеличение общего количества WBC на 31.9%; тромбоциты на 59,7%; палочкоядерные нейтрофилы на 8,9%; лимфоциты на 9,7%; моноциты — в 2,4 раза; снижение эозинофилов — в 10,3 раза. Такое изменение состава лейкоцитов можно объяснить перераспределением объема крови, связанным с расширением желудка и заворотом желудка, и усилением механизмов индукции фагоцитарной активности макрофагов. На 1-е сутки после операции изменения общего клеточного состава и гемограммы были более значительными. Общее количество WBC увеличилось на 16,8% по сравнению с количеством на момент поступления и на 54.2% от физиологической нормы. Количество палочкоядерных нейтрофилов увеличилось на 37,5% по сравнению с физиологической нормой. В это время на гемограмме присутствовали нейтрофилы солитарной полосы без значительного сдвига гемограммы влево с уменьшением количества лимфоцитов на 33,7%. Это свидетельствует об иммунодепрессивном состоянии организма. Возможно, это вызвано спленэктомией и воздействием анестезии — дегенеративным смещением нейтрофилов. В то же время эти изменения можно связать с усилением токсических эффектов из-за появления мертвых тканей, накопления протеолитических ферментов, экзо- и эндотоксинов.Эта информация подтверждается рядом исследований (Walshaw, Jonston, 1986; Fernandes et al., 2001; Fossum, Hetlund, 2002; Пулняшенко, 2004; Brockman, Drobajau, 2005; Ватников, 2009).

Обращает на себя внимание значительное снижение количества тромбоцитов на 33,7% по сравнению с физиологической нормой. Количество тромбоцитов в первые сутки после операции было близко к критическому. С одной стороны, это вызвано спленэктомией, а с другой — повышенным потреблением тромбоцитов из-за массивного хирургического вмешательства.Также мы наблюдали моноцитоз, который был в 3,1 раза больше по сравнению с физиологической нормой. На третьи сутки после операции мы отметили продолжающийся рост общего количества лейкоцитов на 82,1% по сравнению с нормальным. Также характерно острое воспаление в сочетании со смещением лейкоцитов влево . На 7-14 сутки отмечается постепенная нормализация показателей крови, общего количества лейкоцитов и тромбоцитов. На 14-й день содержание лейкоцитов и тромбоцитов не имело существенных различий по сравнению с физиологическим диапазоном.Однако мы отметили увеличение количества палочкоядерных нейтрофилов на 32,1%, моноцитов на 78,1%; уменьшение количества лимфоцитов на 25,1%, а эозинофилов — на 19,3%. Это можно объяснить длительным послеоперационным периодом восстановления после расширения желудка и заворота.

Анализ характеристик группы 2 (собаки с переливанием эритроцитов) показал, что количество эритроцитов у животных группы 2 продолжало снижаться на 1-й день после операции, как и у животных 1-й группы.В итоге она упала в 1,47 раза (3,6 ± 0,2 × 10 ⁶ / мл). По сравнению с животными 1-й группы снижение было менее значительным на 9,1% (табл. 2). В то же время уменьшение количества эритроцитов может быть связано с гиперплазией красной пульпы и повышенным расходом эритроцитов. В этот период селезенка имела признаки диффузного кровенаполнения и содержала участки геморрагической импрегнации (Боженова, 2013).

Таблица 2: Изменения гемограмм собак на фоне применения стандартной послеоперационной терапии и переливания эритроцитов

Как видно из таблицы 2, начиная с 3 дня количество эритроцитов начинает неуклонно увеличиваться на 19.44% и 63,89% на 3-й и 7-й дни. На 14-й день количество эритроцитов превысило в 1,3 раза, чем во время первичной госпитализации. Однако до значений физиологической нормы она не достигла. У животных 2-й опытной группы уровни гемоглобина и гематокрита имели отчетливую тенденцию к нормализации. Повышенный уровень гемоглобина по сравнению с исходными значениями при поступлении составил 1,09%; 7,61%; На 1, 3, 7 и 14 день соответственно 35,87% и 1,43 раза. Уровень гематокрита также увеличился: 0.77%; 0,88%; 0,94%; 13,4% соответственно. На 3 сутки оба параметра достигли значений, зафиксированных при поступлении, а на 14 сутки после операции уровень гемоглобина был в пределах физиологической нормы. Более низкая скорость роста уровня гематокрита может быть объяснена наличием большого объема кристаллоидных растворов в кровотоке, поступающем в организм животных в период выздоровления.

Динамика изменения характеристик показателей эритроцитов (MCV, MCH, MCHC, RDW) у животных 2-й группы в послеоперационном периоде по сравнению с этими значениями у животных 1-й группы свидетельствует о более быстром восполнении объема циркулирующей крови, восстановление функции и морфологии эритроцитов.У животных из группы 2 на 1, 3 и 7 дни наблюдения выявлен умеренный ретикулоцитоз 2,15; 3.1; и в 2,75 раза соответственно. Это характеризует адекватную реакцию костного мозга на тяжелую анемию, вызванную патологическим процессом. В послеоперационном периоде развивается смешанный анизоцитоз со значительным снижением нормоцитов и дискоцитов в группе животных со временем от расширения желудка и заворота не более 4-6 часов. Количество эритроцитов с включениями Хауэлл-Джолли также увеличивается после спленэктомии (Боженова, 2013).

Анализ количественного состава лейкоцитов, тромбоцитов и клеточного состава лейкоцитов собак 2-й опытной группы с расширением желудка и заворотом желудка в послеоперационном периоде, получавших традиционную инфузионную терапию и переливание эритроцитов, показал следующие изменения: менее значимые увеличение общего количества лейкоцитов по сравнению с этим показателем у собак 1-й группы. Динамика послеоперационных изменений по дням не имеет достоверных различий у собак 1-й и 2-й групп.По сравнению с 1-й группой молодые формы нейтрофилов выявлялись в гемограмме только на 1-е и 3-е сутки. Количество этих клеток было на 40% меньше, чем у собак 1-й группы. На 7-14 сутки молодые формы нейтрофилов отсутствовали. нейтрофилы в гемограмме. Количество палочкоядерных нейтрофилов на 1-е сутки наблюдений увеличилось по сравнению с данными на момент поступления на 37,7%; в 3-й день — 2,2 раза. Дальнейшие наблюдения выявили постепенное снижение этого показателя, и на 14-е сутки количество палочкоядерных нейтрофилов снизилось до фонового уровня на момент поступления.Однако это было выше физиологической нормы на 17,8%. Такая динамика у собак, которым в послеоперационном периоде было проведено переливание эритроцитов, свидетельствует о более адекватной реакции костного мозга на кровопотерю.

У собак 2-й группы на 1-е сутки послеоперационного периода эозинопения была менее выражена, чем у собак 1-й группы; на 3-е сутки количество эозинофилов увеличилось в 2,4 раза по сравнению с их количеством на момент приема; на 7 день количество эозинофилов увеличилось на 25%; на 14-е сутки она достигла физиологической нормы; у собак 2-й группы, как и у собак 1-й группы, количественный показатель лимфоцитов снизился, хотя лимфопения была менее выраженной.В 1-й день послеоперационного наблюдения не было выявлено критической тромбоцитопении, на 3-й и 7-й дни количество тромбоцитов увеличилось на 44,9% и 60,2%, соответственно, относительно самого низкого уровня, наблюдаемого в 1-й день. Снижение процента лимфоцитов в ходе исследования. день составлял 36,9%; 39,6%; 26,0% и 18,7% соответственно при сравнении с показателем на момент поступления в поликлинику.

У собак 2-й группы в послеоперационном периоде выявлен менее выраженный моноцитоз. Подобную тенденцию можно объяснить усилением иммунного ответа (из-за изменений в инфузионной терапии), улучшением микроциркуляции в тканях, снижением ишемических процессов в тканях, увеличением времени жизни собственных эритроцитов, а также циркуляции в периферическом кровотоке донорские клетки.

Заключение

Таким образом, исследования показали, что при послеоперационном наблюдении за животными анемия выявлялась на 1-7 сутки, а тромбоцитопения — на 1-3 сутки. Тяжелое подавление иммунитета, вызванное анестезией и спленэктомией, было подтверждено лимфопенией и тромбоцитопенией на 1-3 день. Переливание эритроцитов в раннем послеоперационном периоде снижает тяжесть анемии (количество эритроцитов, концентрацию гемоглобина и гематокрит) и тяжесть воспалительного процесса (количество колотых и палочкоядерных нейтрофилов).Переливание упакованных эритроцитов снижает выраженность иммуносупрессивного действия, вызванного спленэктомией, а также эффекты анестезии, вызывая продукцию тромбоцитов, ретикулоцитов и, таким образом, улучшая репаративные процессы в послеоперационном периоде. Переливание упакованных эритроцитов при тяжелой патологии брюшной полости у собак, изучение методов клинического и лабораторного контроля в послеоперационном периоде являются перспективными направлениями развития гемотрансфузиологии в ветеринарной хирургии и могут служить основой для дальнейшего развитие этой проблемы.

Список литературы

1. Бажибина Е.Б., А.В. Коробов, С. Середа и В. Сапрыкин, 2004. Методические основы оценки клинико-морфологических показателей крови домашних животных. Москва: Аквариум, 128 с.
.
2. Боженова Е.Ю., 2013. Клинико-морфологическая характеристика эритробластного зачатка в послеоперационном периоде при дилатационном завороте желудка у собак, Автореф. Дис. Канд. Ветеринарных наук, с: 19.
3. Ватников, Ю.А., 2009. Иммунотерапия репаративного остеогенеза у экспериментальных животных. Монография, М .: РУДН, с: 214.
.
4. Голева А.А., 2015. Мониторинг осложнений у собак с расширением желудка и заворотом желудка. Материалы Международной научно-практической конференции: Теоретические и прикладные проблемы современной науки и образования, Курск, 27-28 марта, часть II, с: 72-75.
5. Голева, А.А. и Ю.А. Ватников, 2014. Динамика функциональной активности эритроцитов у собак с расширением желудка и заворотом желудка.Российский ветеринарный журнал (домашние животные), 5: 15-17.
6. Голева А.А., Я.А. Ватников, Е.Ю. Боженова, 2014. Прогностические аспекты функционального состояния эритроцитов в послеоперационном периоде у собак с расширением желудка и заворотом желудка. Теоретические и прикладные проблемы сельского хозяйства, 1 (18): 52-54.
7. Недобежкова, Е.Ю. и Ю.А. Ватников, 2013. Структурно-функциональное состояние эритроцитов у собак с расширением желудка и заворотом желудка. Теоретические и прикладные проблемы сельского хозяйства, 3 (16): 45-47.
8. Недобежкова Е.Ю., Ю.А. Ватников, С.В. Позябин, 2013. Мониторинг послеоперационных осложнений у собак с расширением желудка и заворотом желудка. Ветеринарная патология, 3: 92-95.
9. Позябин С.В., 2013. Разработка и обоснование методов диагностики и хирургического лечения животных с аномалиями желудка и селезенки, Автореферат диссертации доктора ветеринарных наук, Москва, с: 41.
10. Пулняшенко П.Р., 2004. Расширение желудка и заворот желудка у собак.Киев: ООО «Алеф», стр: 160.
.
11. Холл, Э., Д. Симпсон и Дж. Уильямс, 2010. Гастроэнтерология у собак и кошек. Москва: Аквариум — Принт, с: 408.
.
12. Brockman, D.J. и К.Дж. Дробаяу, 2005. Синдром расширения желудка у собак в ветеринарном отделении интенсивной терапии: 295 случаев. J. Американской ветеринарной медицинской ассоциации, Vol. 21, 3: 460-464.
13. Фернандес, С.Дж., Акамине Н., Ф.В. DeMarco et al., 2001. Переливание эритроцитов не увеличивает потребление кислорода у пациентов с сепсисом в критическом состоянии.Critical Care, 5: 362-367.
14. Fossum, T.W. и К.С. Хетлунд, 2002. Хирургия мелких животных. Мосби, стр: 1400.
15. Хиггс, Д.Р., и У.Г. Вуд, 2005. Эритропоэз. Ред., Хоффбранд, А.В. и Д. Тадденхэм. EDSG Аспирантура гематологии, 5-е изд. Мэйден, Массачусетс: Блэквелл, стр: 13-25.
16. Kucera, W., W. Meier, D. Lerche, et al., 1984. pH-Wert и osmolaria tsbedingte Veranderungen deformierbarketsbeestimmender Factoren fun die Filtrierbarkeit mensch-leeher Erythrozyfen / Biomed.Биохим. Acta, Bd.43, 3: 337-348.
17. Mooney, E., C. Raw и D. Hughes, 2014. Концентрация лактата в плазме как прогностический биомаркер у собак с расширением желудка и заворотом желудка. Темы в медицине домашних животных, Vol. 29, 3: 71-76.
18. Пасупулети, Л.В., Л.Е. Библия, Z.C. Сифри, У.Д. Альзате, Д.Х. Ливингстон, А.М. Мор, 2014. Хронический стресс после травмы приводит к стойкой посттравматической анемии. Журнал хирургических исследований, Vol. 186, 2: 589-590.
19. Такахаши, Ю., Х. Хенми, Яракис и др., 1983. Деформируемость эритроцитов у пациентов с цереброваскулярными заболеваниями. Microvase Res., Vol. 26, 3: 369.
20. Walshaw, R. and D.E. Jonston, 1986. Лечение заворота желудка путем декомпрессии желудка и стабилизации пациента перед серьезной операцией / J. Являюсь. Anim. Hosp. Жопа. — — № 9. — С. 18-20.

Top 10 San-Lazaro Hotels-2021 Рейтинг роскошных отелей

«Приглашенный на ближайший конгресс, наш хозяин зарезервировал для нас номер в отеле Pamir.Читая отзывы до нашего приезда, мы были уверены, что наше пребывание обернется большим разочарованием. Что ж, все было с точностью до наоборот. Администратор был профессиональным, эффективным и показал хорошее знание английского языка. Наш номер был отремонтирован, чист, оборудован двумя шкафами, красивой ванной комнатой, и что мне больше всего понравилось, так это количество элементов освещения, которые давали исключительный свет как в комнате, так и в ванной, что не так часто встречается во многих других отелях. Качество сна было отличным. Завтрак подавали в соседнем отеле в новой элегантной столовой.Качество еды было хорошим. Однако, если вы хотите выпить капучино, вам придется заплатить дополнительно. Атмосфера в столовой для завтрака была очень приятной. Один минус: в вечернее и ночное время вестибюль гостиницы почти безлюден. Уборка номеров оставляет желать лучшего. Еду в номер приносили в картонных коробках. Это вопрос, который следует рассмотреть руководству. «
» * планирование здания очень запутанное * номер в отеле слишком красочный — выглядит как детская спальня * грязное постельное белье по прибытии (см. Фото) * магазинов в пути нет расстояние * красивая природа вокруг * действуют все амнистии * очень быстрый въезд и выезд из центра * на приемлемом расстоянии от обоих — Шертемьево и Внуково Аэропорты «
» Я редко оставляю замечание об отеле, но в данном случае я вынужден сделать это.К сожалению, то, что делает этот отель очень плохим, касается всего. Начиная с плохого приема и обслуживания клиентов, грубости и холодности, завтрак очень плохой, инфраструктура беспорядочная и без какой-либо помощи, ресторан (который, кстати, является кафетерием) выглядит как школьный кафетерий и закрывается в 20:00. Есть еще один вариант — открытое позднее кафе, но еда только полутеклая, и у них есть идея, что можно не разговаривать с вами и подавать блюда через 20 минут. Номера в отеле чистые, по крайней мере! Честно говоря, этого следует избегать, это должен быть 2-звездочный отель.Надеюсь, это скоро кто-нибудь заметит ».

Посмотреть предложения

Совместная локализация и ограничение эктонуклеотидаз модулируют внеклеточное распределение аденозиновых нуклеотидов

Обзор

Мы использовали вычислительную модель для количественной оценки того, как конфигурация NDA CD39 и CD73 в близко расположенных плазматических мембранах контролирует последовательную нуклеотидазную активность и локальные пулы нуклеотидов. Эти ферменты катализируют превращение АТФ непосредственно в АМФ и АМФ в Адо соответственно.Это исследование было исследовано в модельной геометрии стыка, для которой можно было контролировать пористость материала и состав поверхности (рис. 1). Геометрия модели дополнительно поясняется в разделе Геометрия модели. В нашем подходе использовалась модель уравнения в частных производных на основе конечных элементов, разработанная в [53], для которой мы ввели явные ферменты [27], чтобы количественно оценить, как такие условия, как заряд липидов, ионная сила и локализация в мембране, регулируют эффективность белка. функции, которые используют диффундирующие нуклеотидные субстраты.Мы наложили градиент АТФ, ориентированный параллельно стыку, чтобы имитировать диффузию АТФ из окружающей среды к ферментам CD39 и CD73. С помощью этой модели мы исследуем, как совместная локализация ферментов, «привязывая» ферменты к стенке соединения (для представления мембранно-связанных конфигураций), и как заряды на поверхности фермента и соединения формируют кинетику фермента в объеме соединения, как обобщено в Теории. . Наши ключевые выводы заключаются в том, что совместная локализация NDA и их зарядовая комплементарность с субстратами могут компенсировать снижение скорости реакции из-за их ограничения до наноразмерных переходных объемов; кроме того, настройка свойств поверхности соединительной мембраны, таких как плотность заряда, дополнительно улучшает эффективность нуклеотидазной реакции и модулирует результирующие пулы нуклеотидов.Эти исследования подтверждают, что на последовательную активность CD39 и CD73 сильно влияет конфигурация их внеклеточного, соединительного окружения и кинетика реакции выхода, которая заметно отличается от сравнений в объемной фазе in vitro.

Рис. 1. Системы, исследуемые в данной работе.

Слева) Схема синапсовидного соединительного пространства, образованного между соседними клетками. Нуклеотидазы, заключенные в соединительном пространстве, гидролизуют аденозинтрифосфат (АТФ) в аденозинмонофосфат (AMP) и аденозин (Ado) через CD39 и CD73 соответственно.Справа) Схема имитируется геометрией модели соединения, для которой резервуары соответствуют внеклеточной среде, окружающей пространство соединения. Пространственная и электростатическая конфигурации фиктивного синаптического соединения влияют на реактивность ограниченных нуклеотидаз CD39 и CD73, которые, в свою очередь, контролируют локальную концентрацию нуклеотидных сигналов.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1007903.g001

Влияние ограничения молекулярных соединений на ферментативную активность

Реакции сопряженных ферментов широко изучались в различных контекстах, включая изолированные глобулярные ферменты и вдоль поверхностей.Здесь мы расширяем эти подходы для изучения кинетики реакции гидролиза нуклеотидов для ферментов NDA, встроенных в наноразмерные промежутки между клетками, которые мы имитировали с помощью соединений различной ширины (см. Рис. 1). Эти соединения представляют собой небольшие, хорошо удерживаемые внеклеточные объемы, такие как соединения, образованные между соседними клетками или синапсирующими нейронами. Мы варьируем относительное расстояние между ферментами, чтобы исследовать, как совместная локализация влияет на эффективность реакции, а также их расстояние до поверхности соединительной мембраны для имитации поверхностно-привязанных ферментов по сравнению с свободно плавающими.В такой геометрии доступ субстрата к ферменту ограничен узким объемом, что, как ожидается, снизит скорость реакции, ограниченную диффузией. Чтобы количественно оценить зависимость реакционной способности фермента от объема соединения, мы численно решили модели реакции-диффузии (уравнение 12) для субстратов АТФ, АМФ и Ado с учетом граничных условий, определенных в Теории. Мы определили эффективность реакции как отношение коэффициента скорости продуцирования субстрата Ado, k _{prod , Ado} по отношению к коэффициенту скорости ассоциации субстрата ATP, k _{на , ATP} .Мы предполагаем, что скорость продукции Ado равна скорости ассоциации AMP, следовательно, эффективность реакции показывает, как реакционная способность AMP формируется конфигурацией системы независимо от скорости реакции ATP.

Сначала мы проверяем нашу модель в сравнении с аналитическим решением для коэффициента скорости реакции, ограниченной диффузией, для однородно реактивной сферы в сферически-симметричной бесконечной области. Здесь коэффициент скорости ассоциации, k _на , для реактивного фермента равен [54, 55]: (1) в которой R, — радиус фермента, а D — коэффициент диффузии субстрата.В целях проверки мы оцениваем эту скорость на сфере (радиус 2,0 нм), предполагая однородную концентрацию АТФ (1,0 мМ) как в резервуаре, так и на стыке (диаметр 32,0 нм). В этой конфигурации использовался единственный фермент CD39 в цилиндрическом соединении с радиусом 16 нм и длиной 80 нм. Таким образом, концентрация фермента в этом моделировании составляет одну частицу в объеме соединения примерно 64,340 кубических нм, что эквивалентно примерно 0,03 мМ. В дальнейшем мы будем называть это «групповой» конфигурацией.В этих условиях мы численно оценили коэффициент скорости k _{на , ATP} = 26,67 нм ³ нс ^-1 , что находится в пределах 6% от аналитической оценки k _{smol , навалом} = 25,17 нм ³ нс ⁻¹ . Это служит нашей ссылкой для нормированных скоростей, представленных на рис. 2. Незначительное расхождение можно отнести к несферической области, используемой для численного моделирования, тогда как в уравнении 1 предполагается радиально-симметричная область.

Рис. 2. Эффекты ограничения и близости.

Прогнозируемые коэффициенты скорости реакции для АТФ на АМФ на ферменте CD39, нормализованные к аналитическому значению из уравнения 1. Основная геометрия представлена ​​одним ферментом CD39 в стыке радиусом 16 нм с АТФ = 1,0 мМ на всех границах ( чернить). Результаты для различных диаметров стыка представлены (синим цветом), включая конфигурации, в которых фермент находится в центре стыка или примыкает к стенке стыка.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pcbi.1007903.g002

Для проверки предсказаний модели в геометрии сочленения мы определяем граничные условия, которые накладываются на конечном радиальном расстоянии αR . Аналитическое решение уравнения диффузии Фика с учетом конечного радиального расстояния для граничного условия дает выражение (2) из уравнения 1. Чтобы проверить нашу модель для ферментов, ограниченных соединением, мы провели моделирование с параметрами, аналогичными описанным выше объемным условиям, за исключением того, что граничные условия вдоль соединения были изменены на отражающие граничные условия (нулевой поток через внешнюю поверхность перехода).Данные о концентрации, извлеченные из этого моделирования, были оценены для определения радиального расстояния, на котором поле концентрации больше не определялось присутствием фермента CD39, которое составляло приблизительно 3 R ( α = 3), на основе визуального осмотра. значений концентрации. На этом расстоянии средняя концентрация АТФ составляла примерно 0,3 мМ. Вычисление k _{на , ATP} из этого моделирования привело к результату k _{на , ATP} = 10.83 нм ³ нс ⁻¹ . Это значение находится в пределах 5,0% от результата использования α = 3 в уравнении 2, k _{smol , локальный} = 11,33 нм ³ нс ⁻¹ . Эти подходы (см. Также S1 Text) подтверждают надежность вычислительной модели для воспроизведения аналитических результатов для реакций ассоциации, ограниченной диффузией.

Используя нашу подтвержденную модель, мы исследовали, как на реакцию субстрата АТФ на CD39 влияет ограничение в пределах наноразмерного перехода.Это моделирование проводилось в предположении постоянного градиента концентрации вдоль основной оси канала. На рис. 2 представлены нормализованные скорости ассоциации АТФ с ферментом CD39, при условии постоянного радиуса фермента ( r _E = 2,0 нм) и различных радиусов соединения ( r _j ≈ 2− 16 нм). Ограничение одного фермента соединением снижает коэффициент скорости реакции примерно на 60-80% по сравнению с соответствующей скоростью в массе () (рис. 2).Отчасти это снижение связано с наложением градиента концентрации АТФ на стыке, тогда как в больших случаях использовалось постоянное значение АТФ на его внешней границе. Это снижение скорости может быть качественно объяснено профилями концентрации, проявляющимися в канале (см. Рис. A на Рис. S1). Профиль концентрации уменьшается с [ATP] = 6.0 × 10 ^-4 нм ^-3 в правом резервуаре (Γ _R ) и приближается к нулю в левом резервуаре (Γ _{). L} ).Далее, по мере уменьшения радиуса перехода от r _j ≈ 8 r _E до r _j ≈ r _E концентрация A в пределах сочленения уменьшилась еще больше относительно источника коллектора. Оба фактора снижают концентрацию субстрата на поверхности фермента, что приводит к снижению k _{на , ATP} .

Мы дополнительно варьировали близость фермента к поверхности стыка. Это служило прокси для исследования реакционной способности ферментов, которые по существу свободно плавают внутри соединения по сравнению с иммобилизованными на поверхности соединения. Реакционная способность CD39 была дополнительно снижена, хотя и незначительно, поскольку CD39 локализовался на поверхности соединения. Скорее всего, это связано с уменьшением доступного для субстрата объема вокруг фермента. Этот эффект также можно рационализировать, отметив сходство между уравнением диффузии, не зависящим от времени, и уравнением Лапласа, обычно используемым в электростатике (см. Уравнение 15 с κ = 0 и обоснование в S1 Text).В целом, эти результаты демонстрируют, что ограничение диффузии АТФ внутри соединения и в несколько большей степени вблизи стенки соединения подавляет k _{на , ATP} относительно основной массы.

Ожидается, что уменьшение k _{на , ATP} за счет ограничения ферментов впоследствии приведет к снижению скорости продукции AMP и Ado. На практике, чтобы конкурировать с этим сокращением, ферменты часто совместно локализуются, чтобы настроить скорость производства желаемых химических продуктов [43, 45, 56].Поэтому мы ввели второй фермент, CD73, в соединение и смоделировали стационарные реакции ATP → AMP на CD39 и AMP → Ado на CD73. На рис. 3 мы сначала приводим коэффициенты скорости продуцирования Ado, k _{prod , Ado} , как функцию разделения ферментов и для поверхностей соединения, которые не являются реактивными (отражающими) или реактивными (поглощающими) для AMP. средний. Эти значения нормализованы относительно значения k _{prod , Ado} , полученного для r _j ≫ r _E и минимального разделения ферментов ( d CD 39, CD 73 ≈ 4 нм).На нормализованные коэффициенты скорости k _{prod , Ado} незначительно влияет уменьшение разделения ферментов при наличии границ, которые не реагируют с AMP. Это указывает на то, что колокализация ферментов оказывает незначительное влияние на k _{prod , Ado} в нереактивных граничных условиях. Напротив, мы используем условия поглощения, чтобы представить сценарии, в которых ферменты, вспомогательные для NDA, могут истощать нуклеотидные промежуточные соединения.Здесь мы наблюдаем кинетическое преимущество колокализации ферментов, которое демонстрируется повышенными скоростями при уменьшении d _{CD 39, CD 73} на фиг. 3, которые дополнительно усиливаются по мере увеличения размера соединения. Следовательно, по мере того, как домен приближается к объемной системе, в которой AMP может ускользать из реакционного комплекса, преимущество близости фермента становится очевидным и согласуется с недавними исследованиями совместной локализации фермента [23, 45, 46]. Таким образом, природа взаимодействий промежуточных продуктов (AMP) с поверхностью, по-видимому, определяет относительное преимущество совместной локализации ферментов в закрытых наноразмерных доменах.

Рис. 3. Влияние ограничения и совместной локализации нуклеотидазы на скорость продукции аденозина (Ado).

Нормализованный коэффициент скорости реакции, k _{prod , Ado} , для CD73 с разными размерами переходов и близостью CD39 / CD73. нормализовано относительно максимального значения k _{prod , Ado} , которое находится в условиях минимального расстояния разделения ферментов и максимального радиуса соединения.Красные линии предназначены для поглощения граничных условий для имитации условий, в которых мембрана конкурирует за промежуточный продукт AMP. Синие линии соответствуют отражающим граничным условиям, чтобы представить мембраны, которые не реагируют на подложку. Толщина линии пропорциональна радиусу стыка.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1007903.g003

Чтобы очертить эффекты ограничения соединения и колокализации ферментов на k _{на , AMP} и k

Рис. 4. Влияние ограничения и совместной локализации нуклеотидазы на эффективность продукции Ado.

Эффективность реактивности CD73 по отношению к CD39, определяемая как k _eff ≡ k _{prod , Ado} / k _{на 3}

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1007903.g004

На рис. 5 мы суммируем относительные концентрации АТФ и его производных, поддерживаемые в соединении с помощью последовательно связанных NDA. Мы представляем результаты для концентраций нуклеотидов в средней точке между ферментами CD39 и CD73, разделенными расстоянием 10 нм, с концентрацией АТФ 1 мМ на границе резервуара. Эти данные (незаряженная масса, незаряженная нереактивная и незаряженная реактивная мембрана) показывают, что ограничение обычно снижает общую концентрацию нуклеотидов по сравнению с массой.Однако заключение приводит к более высокому соотношению Адо по сравнению с АТФ по сравнению с объемным состоянием.

Рис. 5. Концентрации АТФ, АМФ и Ado на среднем уровне между ферментами.

CD39 и CD73 разделены расстоянием 10,0 нм. В незаряженном корпусе все поверхности электрически нейтральны. В заряженных случаях применяются поверхностные потенциалы, как описано в разделе «Влияние поверхностного заряда на коэффициент скорости реакции». Объемные условия (черный и серый) соответствуют описанию в разделе «Влияние ограничения молекулярных соединений на ферментативную активность».В нереактивных случаях (синий) поверхность соединения отражает нуклеотиды, в то время как в реактивных случаях (красный цвет) поверхность соединения поглощает АМФ. Также показаны (зеленым) случаи, когда фермент CD39 неактивен, что не приводит к продукции AMP или Ado.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1007903.g005

Влияние поверхностного заряда на коэффициент скорости реакции

В предыдущем разделе мы продемонстрировали, что ограничение CD39 и CD73 наноразмерными внеклеточными компартментами подавляет общий коэффициент скорости реакции незаряженных субстратов.Кроме того, совместная локализация реактивных центров в некоторой степени смягчила это сокращение. Однако аденозиновые субстраты обычно заряжены, причем наибольший отрицательный заряд имеет АТФ, а наименьший — Адо. Следовательно, ожидается, что их концентрации и скорости диффузии будут чувствительны к конфигурации заряда их партнеров по связыванию и окружающей среды липидного бислоя. Например, хорошо известно, что многие ферменты эволюционировали, чтобы использовать электростатические взаимодействия для ускорения связывания субстрата [41].Кроме того, есть убедительные доказательства того, что локальная концентрация ионов около заряженных мембран дает концентрации заряженных частиц, таких как Ca ²⁺ и Na ⁺ , которые значительно отклоняются от основной массы [57, 58]. Поэтому мы расширили подход в предыдущем разделе, чтобы рассмотреть конкурирующие или дополнительные эффекты электростатических взаимодействий в связанной активности NDA.

Сначала мы проверяем нашу модель с электростатическими взаимодействиями, используя уравнение электродиффузии Смолуховского (см. Уравнение 8), для которого электростатический потенциал моделировался с использованием линеаризованного уравнения Пуассона-Больцмана (см. Уравнение 15).Сначала мы проверяем нашу реализацию в условиях разбавленного растворителя ( κ → 0) и предполагаем, что переход и CD73 не заряжены. Скорость ассоциации в этой конфигурации для подложки с зарядом q _A со сферически-симметричным ферментом E радиуса r _E и заряда q _E можно определить аналитически [23]: (3) с Q _S ≡ q _A q _E λ _B , где r D радиус реакция ограничена, и λ _B — длина Бьеррума.Соответственно, мы демонстрируем на рис. B на рисунках S1, что для κ → 0, что k _{на , ATP} скорости для q _A = -1 и q _E ∈ [0, 3] приближаются к аналитической оценке с точностью до 15% и, таким образом, обоснованно подтверждают электростатическую модель. Мы объясняем расхождение частично из-за несферической геометрии системы, тогда как точная сфера предполагается в уравнении 3.

Используя подтвержденную модель электродиффузии, мы исследовали изменения реакционной способности CD39 за счет ограничения в пределах электрически нейтрального перехода, подверженного электростатическим взаимодействиям между отрицательно заряженным субстратом АТФ, положительно заряженным CD39 и CD73 с различными зарядами.Мы предположили, что поверхностные потенциалы для ферментов равны ± 25,6 мВ (эквивалент), что находится в том же порядке, что и потенциалы ζ , измеренные для белковых растворов Салгн и др. [59]. Кроме того, хотя заряды метаболита аденозина варьируются от -4 до 0, АТФ обычно хелатируется Mg ²⁺ [60], поэтому мы использовали заряды -2, -1 и 0 для АТФ, АМФ и Адо, соответственно, чтобы проиллюстрировать влияние на реактивность.

Затем мы наложили отрицательный электрический потенциал на поверхность соединения и представили результирующие коэффициенты скорости реакции (красный цвет на рис. 7).Мы выбрали плотности поверхностного заряда, соответствующие биологическим мембранам, полученным с помощью микроскопии поверхностной проводимости, такие как DPTAP = 15,1 мКл м ^-2 , DPPE = 5,3 мКл м ^-2 и DPPG = -44,0 мКл м ^-2 для положительно заряженных, цвиттерионный и отрицательно заряженный липидный бислой соответственно [61]. Эквивалентный электрический потенциал для этих плотностей заряда может быть получен из уравнения Грэма (уравнение 16 в теории).

На рис. 5 мы сначала указываем концентрации нуклеотидов для нереактивного CD39 (зеленый), чтобы показать, как фермент и поверхностные заряды влияют на распределение АТФ относительно центров нуклеотидазы в отсутствие активности фермента.Это делается для определения вклада заряда мембраны в локальную концентрацию до рассмотрения кинетики фермента. А именно, мы наблюдаем умеренное снижение АТФ в незаряженной системе по сравнению с концентрацией, установленной на границе резервуара. Когда на мембрану накладывается значительный притягивающий заряд, локальная концентрация АТФ увеличивается в несколько раз. Сравнение заряженных и незаряженных нереактивных состояний наводит на мысль о том, как электростатические взаимодействия локализуют субстрат по отношению к ферментам и тем самым повышают эффективность реакции.

В условиях заряженных белков и субстратов с нейтральными мембранами, k _{на , ATP} уменьшается по мере уменьшения отношения радиуса соединения к ферменту, что согласуется с наблюдениями для нейтральной системы (см. Рис. ). Важно отметить, что k _{на , ATP} для заряженного фермента действительно предполагает более высокий коэффициент скорости, чем нейтральная система; в этом качестве электростатические взаимодействия 1) уравновешивают снижение коэффициентов скорости реакции из-за ограничения и 2) достигают быстрой ассоциации за счет комплементарности заряда нуклеотидов / NDA.

Рис. 6. Влияние электрического потенциала мембраны перехода на реактивность CD39.

k _{на , ATP} показан для различных радиусов соединения. Черные кривые представляют собой случаи, когда поверхность мембраны соединения электрически нейтральна. Синие кривые представляют случаи, когда поверхность мембраны соединения имеет электрический потенциал, который притягивает АТФ. Красные кривые представляют случаи, когда поверхность мембраны соединения имеет электрический потенциал, отталкивающий АТФ.Φ _{CD 39} = 0, если не указано иное.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1007903.g006

Далее мы исследуем влияние электрического потенциала перехода Φ _{переход} на кинетику реакции, если предположить, что CD73 не заряжен. На рис. 6 мы демонстрируем, что в целом k _{на , ATP} монотонно уменьшается с уменьшением размера перехода независимо от заряда мембраны. В том случае, если взаимодействия переходов с субстратом АТФ являются отталкивающими (Φ _{переход} <0), коэффициент скорости реакции уменьшается с большей скоростью.Однако в определенных режимах было обнаружено, что зарядовая комплементарность поверхности перехода значительно ускоряет k _{на , ATP} относительно нейтрального перехода, тогда как отталкивающий переход (Φ _{переход} <0, красный ) ослаблено k _{на , ATP} более чем на 30% для большей части диапазона размеров перехода. Мы связываем повышенный коэффициент скорости реакции для положительно заряженной мембраны с повышенной концентрацией рядом с мембраной по сравнению с концентрацией незаряженной мембраны.А именно, дополнительная заряженная поверхность соединения втягивает АТФ внутрь соединения и тем самым способствует реакции на CD39. Следовательно, заряд поверхности соединения, происходящий от различных фосфолипидных композиций, может сильно влиять на k _{на , ATP} и, в свою очередь, в конечном итоге контролирует продукцию AMP.

Интересно, что взаимодействия привлекательного соединения / АТФ первоначально ускоряются k _{на , ATP} при уменьшении диаметра соединения, после чего скорость снижается.Мы обнаружили, что максимальное ускорение достигается, когда размер соединения примерно в семь раз превышает радиус фермента. Этот максимум зависит от амплитуды потенциала стенки. А именно, когда амплитуда потенциала притягивающей стенки увеличивается, максимумы смещаются в сторону меньших соотношений размера соединения / фермента. В предыдущих исследованиях [53, 62, 63] было продемонстрировано, что слабо притягивающие взаимодействия с границами перехода могут усиливать диффузию и ионную проводимость, что согласуется с начальным увеличением k _{на , ATP} в наша модель.Однако это ускорение диффузии из-за взаимодействий притяжения в конечном итоге перевешивается препятствием диффузии по мере сужения стыка. Кроме того, хотя диффузия, вероятно, ускоряется, количество субстрата, способного взаимодействовать с мишенью, уменьшается, как мы наблюдали для незаряженных случаев. Следовательно, потенциалы притягивающего перехода служат для совместной локализации субстратов возле стенки перехода и, следовательно, компенсируют уменьшенный реакционный объем, который в противном случае уменьшил бы общий коэффициент скорости реакции (см. Рис. C на рисунках S1, особенно для высокой ионной силы).

Точно так же мы изначально ожидали, что закрепление белка на клеточной мембране (условие, приближенное к размещению белка рядом с поверхностью мембраны) улучшит реактивность относительно центра соединения. Хотя мы наблюдали, что k _{на , ATP} могут быть усилены, когда ферменты привязаны к поверхности соединения при определенных условиях, а именно широких соединениях и сильном притяжении, преимущество обычно незначительно и, следовательно, имеет ограниченные последствия для Соглашения о неразглашении (рис. C на рисунках S1).Это, по-видимому, является следствием снижения способности субстрата получать доступ к ферменту, когда он прилегает к соединительной мембране, что уравновешивает повышенную концентрацию АТФ у поверхности из-за привлекательных электростатических взаимодействий.

Электростатическое усиление k _{на , ATP} обычно должно продвигать k _{на , AMP} и k _{prod61 , prod61 , prod61 , prod61 , prod61 , prod61 , Таким образом, мы исследовали степень влияния заряда промежуточных частиц и близости ферментов k prod , Ado (см. Рис. 7), предполагая отрицательно заряженный промежуточный продукт AMP ( z AMP = -1). В соответствии с выводами нейтральной системы и нашими предыдущими исследованиями последовательной передачи ферментов [23], мы обнаружили, что k prod , Ado увеличивается, когда ферменты находятся в непосредственной близости ().Как отмечалось в предыдущем разделе, границы поглощающего перехода демонстрируют наибольшую чувствительность к расстоянию между ферментами, с благоприятными электростатическими взаимодействиями AMP / CD73 для Ω CD 73 > 0, что приводит к более быстрому k prod , Ado коэффициенты скорости реакции относительно нейтрального CD73. Напротив, наблюдались более низкие скорости для отрицательно заряженного CD73. Усиление в первом случае отражает электростатическое притяжение субстрата АМФ к ферментам, что предотвращает его диффузию от ферментов.Об этом поведении также сообщалось в [23] для неограниченной (объемной) системы, для которой скорости реакции были максимальными, когда заряженные ферменты были совместно локализованы. Когда CD73 был заряжен отрицательно, АМФ отталкивался от фермента, притягиваясь к CD39, что приводило к значительному снижению скорости его реакции. Следовательно, зарядовая комплементарность ферментов их соответствующим субстратам, а также совместная локализация ферментов вместе увеличивают общий коэффициент скорости реакции по сравнению с незаряженными системами, что согласуется с [23, 45, 46].Важно отметить, что электростатическое усиление эффективно уравновешивает снижение скорости из-за ограничения ферментов узким соединительным пространством. В тексте S1 мы обсуждаем взаимосвязи между k prod , Ado и силой взаимодействия AMP / мембраны, а также сопутствующие эффекты на эффективность реакции k eff .}

Рис. 7. Влияние CD73 и электрического потенциала мембраны на реактивность CD73.

z _ATP = -2, z _AMP = -1, z _Ado = 0 и Ω _{CD 39} > 0. Коэффициенты скорости реакции для производства Ado в зависимости от расстояния между ферментами. Значения нормализованы к значению k _{prod , Ado} , найденному для минимального расстояния разделения ферментов для каждого граничного условия в нейтральном случае.Слева: реактивный; справа: не реагирует на AMP.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1007903.g007

В целом тенденции, наблюдаемые для относительных концентраций нуклеотидов, возникающие в объемных, нереактивных и реактивных условиях для заряженных систем, показанных на рис. незаряженные конфигурации. Важно отметить, что концентрация АТФ значительно выше для основной системы, когда CD39 принимает положительный заряд по сравнению с незаряженной системой, поскольку фермент притягивает свой субстрат.В результате концентрации AMP и Ado были пропорционально выше как для реактивных, так и для нереактивных случаев. В замкнутых системах с заряженными мембранами и ферментами АТФ истощался по сравнению с незаряженной конфигурацией, поскольку мембранный потенциал оттягивал субстрат от ферментов. Тем не менее, [AMP] и [Ado] были больше для обвиняемых случаев по сравнению с их незаряженными эквивалентами.

На фиг. 5 сравнение соответствующих нереактивных конфигураций CD39 (зеленый) с их реактивными эквивалентами CD39 (синий) демонстрирует, как реактивность ферментов модулирует устойчивые концентрации субстрата.В незаряженном случае общая концентрация АТФ и его производных не изменяется при активации ферментов. Напротив, заряженная система представляет снижение общей концентрации всех видов нуклеотидов; Отчасти это происходит из-за того, что заряженная мембрана перераспределяет дифференциально заряженные субстраты от реакционных центров. Сравнение случаев с нереактивными соединительными мембранами (синий) с условиями в массе (черный) иллюстрирует эффекты удержания ферментов. Общая концентрация АТФ и его производных в соединении, предполагающем нереактивную мембрану, значительно снижается по сравнению с общим случаем, который возникает из-за соединения, ограничивающего диффузию АТФ к ферментам.Для реактивной конфигурации мембраны, при которой АМФ потребляется по поверхности (красный), общий пул нуклеотидов был значительно снижен из-за резкого сокращения пулов АМФ и Ado. Мы ожидаем, что более вероятный сценарий пространственно-неоднородной реактивной мембраны или мембраны, которая потребляет только часть локального пула AMP, приведет к распределению нуклеотидов, промежуточному по сравнению с нереактивными и реактивными конфигурациями, показанными здесь.

Наконец, мы исследовали, как на прогнозируемые скорости реакции влияет электростатический экранирование, вызванное распространенными электролитами, такими как KCl.Чтобы смоделировать эти вклады, мы решили линеаризованное уравнение Пуассона-Больцмана, предполагая, что длина Дебая приближается к 1 нм. Эта длина Дебая означает, что электростатические взаимодействия в значительной степени экранируются внутри соединения, что подавляет притягивающие взаимодействия, управляющие быстрыми скоростями реакции, смоделированными в предыдущем разделе. Чтобы оценить эти эффекты на k _{на , ATP} , мы сравниваем скорости как функцию (1 + aκ ), где a — радиус фермента, а κ — обратная длина Дебая. (см. рис. 8).Эта функциональная форма мотивирована [64–66] соотношением (4) где U — электростатическое взаимодействие между субстратом и ферментом. Этот последний термин происходит от обработки растворов электролитов Дебая-Хюккеля.

Рис. 8. Влияние длины Дебая на реактивность последовательных ферментов.

a) Скорость реакции CD39, k _{на , ATP} , как функция параметра длины Дебая ( κ ), который пропорционален квадратному корню из ионной силы.Кружком показаны данные моделирования, а сплошные линии получены путем подгонки к уравнению 4. Подграфик показывает линейную зависимость между ln ( k _на ) и (1 + aκ ) ^-1 . Линейная регрессия уравнения 4 дает силу взаимодействия U / RT и ln k _{на , I → ∞} (см. Таблицу 1). б) Производство и эффективные скорости реакции по сравнению с κ . Сплошные линии соответствуют левой оси ( k _{prod , Ado} ), а пунктирные — правой оси ( k _eff ).

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1007903.g008

На рис. 8 (a) мы демонстрируем, как ln [ k _{на , A} ] масштабируется относительно (1 + κa ) ^-1 , предполагая либо притягивающие, отталкивающие, либо инертные взаимодействия субстрата с соединительной мембраной. Для привлекательных взаимодействий максимальное увеличение скорости по сравнению с электрически нейтральной системой сравнения обнаруживается в условиях разбавления, обозначенных κ → 0 или эквивалентным образом (1 + κa ) ⁻¹ → 1.При высокой ионной силе ( κ → ∞) скорости приближаются к скорости нейтральной системы. В таблице 1 мы демонстрируем, что наши данные хорошо описываются уравнением 4, поскольку коэффициенты корреляции линейной регрессии были больше 0,98. Эта подгонка позволила нам определить эффективные силы взаимодействия U / RT для случаев отталкивания, нейтральности и притяжения как 2,1, 0,0 и -1,1 соответственно. Учет экранирования привел к значительному сокращению k _{на , ATP} по сравнению с условиями отсутствия электролита, принятыми в предыдущем разделе.

Поскольку скорость реакции АТФ была подавлена ​​путем скрининга электролитов, мы также представляем данные о влиянии совместной локализации фермента и близости соединения на k _{prod , Ado} и k _eff , субъект до 150 мМ KCl. Как и ожидалось, k _{prod , Ado} обычно масштабируется пропорционально k _{на , ATP} в результате взаимодействий ATP / соединения, в значительной степени определяющих общий коэффициент скорости реакции относительно промежуточного продукта. (см. рис. 8b, левая ось y).Однако, что интересно, тенденция изменилась на противоположную для k _eff (см. Правую ось Y), то есть отталкивающие взаимодействия AMP / мембраны привели к более эффективным значениям k _eff . Такое поведение можно объяснить отрицательно заряженной мембраной, отталкивающей АМФ по отношению к CD79. Хотя отталкивание мембрана / АМФ улучшало эффективность реакции, влияние на k _{prod , Ado} было небольшим по сравнению с вкладом взаимодействий АТФ / мембрана.Кроме того, мы обнаружили, что тенденции в k _eff и k _{prod , Ado} относительно совместной локализации фермента и близости соединения не сильно отличались от тех, о которых сообщалось в условиях отсутствия электролитов и поэтому здесь не сообщаются. В целом, хотя условия физиологической ионной силы умеренно влияют на кинетику реакции по сравнению с условиями разбавления, изменения довольно незначительны и также нечувствительны к умеренным изменениям ионной силы.