Что такое лайк фак: От лайка до кукиша один фак: История самых популярных жестов

FAK и IGF-IR взаимодействуют, обеспечивая сигналы выживания в клетках аденокарциномы поджелудочной железы человека

Рак поджелудочной железы — это смертельное заболевание, которое является четвертой по значимости причиной смерти от рака в США. Киназа очаговой адгезии (FAK) и рецептор инсулиноподобного фактора роста-I (IGF-1R) представляют собой тирозинкиназы, которые активируют общие пути, что приводит к увеличению пролиферации и выживаемости клеток. Имеется скудная информация об их вкладе в злокачественное развитие рака поджелудочной железы.Мы проанализировали взаимосвязь между FAK и IGF-1R в клетках рака поджелудочной железы человека, определили, какие нижестоящие сигнальные пути изменяются после ингибирования или подавления киназы, и изучили, представляет ли двойное ингибирование киназы потенциальную новую стратегию лечения этого смертельного заболевания. Используя иммунопреципитацию и конфокальную микроскопию, мы впервые показали, что FAK и IGF-1R физически взаимодействуют в клетках рака поджелудочной железы и что ингибирование фосфорилирования тирозина любой киназы нарушает их взаимодействие.Снижение фосфорилирования либо FAK, либо IGF-1R по отдельности приводило к небольшому подавлению жизнеспособности клеток или усилению апоптоза. Однако двойное ингибирование FAK с использованием либо доминантно-отрицательной конструкции (FAK-CD), либо малой интерферирующей РНК, и IGF-1R с использованием специфического низкомолекулярного ингибитора тирозинкиназы (AEW-541) или стабильной экспрессии усеченной мутированной IGF-1R приводил к синергетическому снижению пролиферации клеток и фосфорилирования внеклеточной киназы, регулируемой сигналом (ERK), и увеличению отщепления клеток и апоптоза по сравнению с ингибированием только одного из путей.Двойное ингибирование киназы с помощью FAK-CD и AEW-541 приводило к заметному увеличению апоптоза, когда FAK вытеснялся из очаговых спаек. Ингибирование активности обеих тирозинкиназ с помощью нового единственного низкомолекулярного ингибитора (TAE 226) в низких дозах, специфичных для FAK и IGF-1R, привело к значительному подавлению жизнеспособности клеток, снижению фосфорилирования ERK и Akt и увеличению апоптоза, сопровождаемого расщепление поли (АДФ-рибоза) полимеразы (PARP) и активация каспазы-3 в клетках рака поджелудочной железы.Таким образом, одновременное ингибирование обеих тирозинкиназ представляет собой потенциальный новый терапевтический подход к аденокарциноме поджелудочной железы человека.

FAK / src-Family-зависимая активация Ste20-подобной киназы SLK необходима для зависимого от микротрубочек оборота фокальной адгезии и миграции клеток

Abstract

Миграция клеток включает множество сигналов, которые сходятся при реорганизации цитоскелета, что важно для развития, иммунных ответов и восстановления тканей.Используя нокдаун и доминантно-негативные подходы, мы показываем, что связанная с микротрубочками Ste20-подобная киназа SLK необходима для обмена фокальной адгезии и миграции клеток вниз по течению от комплекса FAK / c-src. Наши результаты показывают, что SLK совместно локализуется с паксиллином, Rac1 и микротрубочками на переднем крае мигрирующих клеток и активируется царапинами. Активация SLK зависит от передачи сигналов FAK / c-src / MAPK, тогда как рекрутирование SLK на передний край зависит от src, но не зависит от FAK.Наши результаты показывают, что SLK представляет собой новый сигнал разборки фокальной адгезии.

Образец цитирования: Wagner S, Storbeck CJ, Roovers K, Chaar ZY, Kolodziej P, McKay M, et al. (2008) FAK / src-Family-зависимая активация Ste20-подобной киназы SLK необходима для зависимого от микротрубочек оборота фокальной адгезии и миграции клеток. PLoS ONE 3 (4): e1868. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0001868

Редактор: Нильс Кордес, Дрезденский технологический университет, Германия

Поступила: 24 сентября 2007 г .; Одобрена: 15 февраля 2008 г .; Опубликован: 2 апреля 2008 г.

Авторские права: © 2008 Wagner et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта работа была поддержана Канадским институтом исследований в области здравоохранения, MDAUSA и награждена премией Premier’s Research for Excellence Award. CJS является стипендиатом Канадского фонда сердца и инсульта. KR поддерживается Канадским фондом рака груди.LAS является лауреатом стипендии CIHR. ЕО поддерживается студентами OGSST и NSERC.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Миграция требуется для многих биологических процессов, таких как развитие, восстановление и регенерация тканей. События передачи сигнала, управляющие миграцией клеток, включают постоянно увеличивающееся количество молекул, функционирующих во взаимосвязанных биохимических путях, регулирующих оборот адгезионных комплексов на переднем крае мигрирующих клеток.Стимуляция клеточной адгезии и миграции индуцирует образование комплексов интегрин-FAK-src, необходимых для рекрутирования и активации ряда адапторных молекул, ведущих к фокальному обороту адгезии и миграции [1] — [3]. В самом деле, FAK-нулевые клетки собирают большие и стабильные адгезионные комплексы, ведущие к миграционным дефицитам [4]. Сходным образом, мутант FAK по тирозину 397, дефицитный по связыванию c-src, неспособен вызвать разборку фокальной адгезии в FAK-дефицитных фибробластах [5] — [7]. Подтверждая это, клетки с дефицитом киназы src-семейства или клетки, экспрессирующие неактивную киназу v-src, обнаруживают более крупные фокальные адгезии, которые не могут быть разобраны [8], [9].

В дополнение к амино-концевому домену серин / треонинкиназы, Ste20-подобная киназа SLK несет центральный домен спиральной спирали и карбоксиконцевой домен гомологии AT1-46 [10] (ATH) [11], [12] ] неизвестной функции. Повышенная экспрессия и активность SLK ведет к быстрой разборке актиновых стрессовых волокон Rac1-зависимым образом [13]. Ранее мы показали, что SLK локализуется в богатых винкулином складках на периферии клеток в распространяющихся фибробластах, подтверждая роль SLK в динамике адгезии [13].В соответствии с ролью в перестройках цитоскелета, SLK, как было показано, косвенно ассоциируется с сетью микротрубочек [13] и необходим для слияния миобластов C2C12 в дифференцированные мышечные трубочки [14]. Интересно, что SLK также, как было показано, регулирует прогрессию клеточного цикла [15]. Кроме того, было показано, что сверхэкспрессия SLK вызывает апоптотический ответ [12]. Подтверждая роль SLK в гибели клеток и клеточном стрессе, расщепление SLK каспазой 3 приводит к его активации [11]. Сходным образом восстановление после аноксии также активирует SLK / p38-зависимый апоптотический ответ [16].

Наши предыдущие исследования показали, что избыточная экспрессия SLK индуцирует быструю разборку актиновых стрессовых волокон, что может быть частично устранено совместной экспрессией доминантно негативного Rac1 [13]. Более того, фибробласты, экспрессирующие активированное укорочение c-конца SLK, неспособны собирать большие периферические адгезии во время распространения на фибронектине, указывая тем самым, что SLK является важным регулятором динамики цитоскелета [13]. Здесь мы показываем, что SLK совместно локализуется с микротрубочками и компонентами адгезии на переднем крае мигрирующих клеток.Мы демонстрируем, что SLK активируется после царапин на монослоях фибробластов FAK-src-MAPK-зависимым образом. Мы обнаружили, что нокдаун SLK или экспрессия доминантно-отрицательной версии приводит к нарушению микротрубочек-зависимого оборота адгезии и замедленной миграции. В целом наши результаты показывают, что SLK является новым регулятором обмена фокальной адгезии и миграции клеток.

Результаты

SLK активируется при нанесении монослоя и необходим для миграции клеток.

Ранее мы показали, что SLK может совместно осаждаться с α-тубулином и что он локализуется в мембранных волнистостях на периферии распространяющихся фибробластов [13].Кроме того, SLK, по-видимому, индуцирует расщепление актиновых стрессовых волокон посредством Rac1-опосредованного пути [13]. Поскольку сигнальные пути, активируемые во время распространения клеток, также регулируют подвижность клеток [1], [2], [17], [18], мы проверили возможность того, что SLK может играть роль в миграции клеток.

Чтобы проверить это, мы первоначально исследовали локализацию SLK и других маркеров цитоскелета после царапин на монослоях фибробластов. Совместное иммуноокрашивание SLK с актиновыми стрессовыми волокнами показывает, что, помимо перинуклеарного распределения, он также обогащен на переднем крае мигрирующих клеток, но не вдоль стрессовых волокон (рис. 1A – C).Сходным образом, на переднем крае, было обнаружено, что SLK совместно локализуется с паксиллином и Rac1 в структурах, напоминающих мембранные складки (рис. 1D – F и J – L). Интересно, что он не локализовался в крупных очаговых спайках, о чем свидетельствует отсутствие совместной локализации с паксиллином на этих участках (рис. 1D – F). Подтверждая наши предыдущие результаты, демонстрирующие со-преципитацию SLK-тубулина [13], SLK локализован совместно с сетью микротрубочек на переднем крае (рисунок 1G – I). Эти наблюдения предполагают, что SLK рекрутируется на переднем крае мигрирующих клеток с другими белками, передающими сигналы адгезии.

Рисунок 1. SLK набирается на переднюю кромку.

Монослои MEF 3T3 на покрытых фибронектином покровных стеклах были поцарапаны и оставлены для миграции в течение 2–3 часов. Монослои иммуноокрашивали на SLK в комбинации с актином (A – C), паксиллином (D – F), α-тубулином (G – I) или Rac1 (J – L). В дополнение к перинуклеарному окрашиванию было обнаружено, что SLK рекрутируется в мембранные складки (стрелки) на переднем крае с другими исследованными маркерами. SLK не был обнаружен в зрелых адгезионных комплексах, о чем свидетельствует отсутствие совместной локализации между SLK и паксиллином в этих структурах (стрелки).Все микрофотографии показаны в 400 ×. Шкала шкалы 10 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0001868.g001

Было показано, что царапины на сливающихся монослоях вызывают поляризацию и миграцию [19], [20]. Поэтому мы исследовали активность киназы SLK в различные моменты времени после индуцированной царапиной миграции монослоев фибробластов. Иммунопреципитация и анализы киназы in vitro и показывают, что активность киназы SLK заметно увеличивается после царапин на конфлюэнтных фибробластах с пиком активности через 60 минут с последующим снижением через 90 минут (рисунок 2).Длительные курсы до 120 минут показали, что активность SLK не возвращается к базальным уровням, наблюдаемым в момент времени 0 (не показано). Вероятно, это связано с продолжающейся миграцией клеток, которая происходит после ранения. Как ранее сообщалось для раненых монослоев астроцитов [20], инактивация GSK3β также происходила с течением времени, что указывает на поляризацию и миграцию раненого монослоя. Вместе эти данные указывают на то, что SLK активируется во время миграции клеток, и предполагают роль SLK в этом процессе.

Чтобы исследовать потенциальную роль SLK в миграции клеток, клетки MEF-3T3 инфицировали аденовирусными векторами, экспрессирующими укороченную киназно-неактивную (DN) форму SLK, SLK ^1–373 K63R (HA-KΔC; [13]), или контроль LacZ, и подвергнутые анализам миграции через лунки. Сверхэкспрессия DN-SLK в фибробластах (фиг. 3A) привела к 60-70% ингибированию миграции на покрытых фибронектином вставках трансвелл (фиг. 3B и C). Чтобы окончательно продемонстрировать роль SLK в миграции клеток, мы трансфицировали молекулы малой интерферирующей РНК (siRNA), специфичные для мышиного SLK, в фибробласты MEF-3T3 и проанализировали их миграцию с помощью анализа через лунки.После трансфекции миРНК уровни белка SLK были эффективно снижены при 5 пМ миРНК и неопределялись при 10 пМ по сравнению с контрольными клетками, обработанными миРНК (фигура 3D). Что касается DN-SLK, клетки, обработанные siRNA SLK, показали уменьшение миграции на ~ 60% по сравнению с клетками, обработанными контрольным siRNA (фиг. 3E и F). В подтверждение этого монослойное ранение shSLK-экспрессирующих клеток показало заметную задержку закрытия раны (рисунок 3G). Вместе эти данные строго подтверждают роль SLK в процессе миграции клеток.

Рисунок 3. Нокдаун SLK или экспрессия доминантно-негативного SLK подавляет миграцию клеток.

Субконфлюентные клетки MEF 3T3 инфицировали аденовирусными векторами, экспрессирующими DN SLK (Ad-HA-KΔC) или контроль LacZ, и подвергали анализам миграции фибронектина (FN) через лунки. (A) Вестерн-блоттинг экспрессии HA-KΔC. Cdc42 использовался в качестве контроля загрузки. (B) Поликарбонатные мембраны окрашивали DAPI, и клетки на нижней стороне подсчитывали (C) в случайных полях и выражали как среднее / поле из трех лунок.(D) Клетки MEF 3T3 трансфицировали миРНК SLK и анализировали на экспрессию SLK. Вестерн-блоттинг обработанных лизатов показывает, что миРНК SLK в концентрации 10 пМ приводит к заметному нокдауну SLK. Повторное зондирование мембраны с помощью антитела против α-тубулина использовали в качестве контроля для загрузки (нижняя панель). (E – F) Клетки обрабатывали SLK-специфическими или контрольными миРНК и анализировали на миграцию через камеру, покрытую бычьим сывороточным альбумином (BSA) (10 мкг / мл) (контроль) или фибронектином (FN) (10 мкг / мл). . В обоих случаях наблюдалось сокращение миграции на 60–70%.(G) Конфлюэнтные клетки MEF3T3 инфицировали аденовирусными векторами, экспрессирующими scramble или SLK shRNA, и вручную царапали кончиком пипетки. За закрытием раны следили в течение 12 часов и оценивали степень закрытия.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0001868.g003

SLK необходим для эффективного оборота фокальной адгезии

Эффективная миграция клеток требует фокального обновления адгезии на переднем крае мигрирующих клеток [2], [4], [6] — [9], [21].Этот процесс зависит от сборки функционального комплекса FAK-src, инициированного автофосфорилированием FAK по остатку тирозина 397 и рекрутирования сигнальных адаптерных белков [1] — [3], [5], [22] — [24]. Интересно, что разрушение микротрубочек ведет к стабильной сборке адгезионных комплексов, характеризующейся высокими уровнями как FAK-Tyr397 [25], [26], так и актиновых стрессовых волокон [26]. В подтверждение этого стабильные адгезии содержат высокие уровни фосфо-FAK-Tyr397 [5]. Вымывание нокодазола приводит к обновлению фокальной адгезии и миграции клеток, характеризующимся циклическими изменениями уровней pY397-FAK [25].Из-за его ассоциации с микротрубочками и потребности в этой структуре в процессе фокального обновления адгезии, мы исследовали роль SLK в зависимом от микротрубочек обороте адгезии.

Клетки MEF-3T3 были инфицированы аденовирусом, несущим DN-SLK, или трансфицированы siRNA SLK и подвергнуты микротрубочко-зависимому обмену фокальной адгезии [25]. Как показано на фиг. 4, после вымывания нокодазолом контрольные обработанные культуры демонстрируют циклические изменения в pY397-FAK.Однако в культурах, где SLK был эффективно сбит, оборот адгезии серьезно нарушен, о чем свидетельствуют устойчивые уровни pY397-FAK. Аналогичным образом, заметная задержка восстановления pY397-FAK (15 мин против 60 мин) наблюдалась в культурах, экспрессирующих DN SLK1-373 ^K63R после отмывки от нокодазола. Как показали результаты иммуноокрашивания pY397-FAK и тубулина, культуры, обработанные нокодазолом, демонстрировали большие очаговые адгезии, которые расслаивались по мере реполимеризации микротрубочек (фигура 4C; t = 15 мин).Однако клетки, экспрессирующие кшРНК SLK, все еще демонстрировали повышенную адгезию после отмывки, что свидетельствует о нарушении обмена. Интересно, что анализы киназы SLK для того же периода времени показали, что ее активность была низкой в ​​клетках с большими адгезиями или высокими уровнями pY397-FAK (фигура 4D). После отмывки от нокодазола активность киназы SLK повышалась в течение 15 минут, поскольку фокальные адгезии демонтировались, и повышалась еще при t = 60 мин, что коррелировало со сниженными уровнями pY397-FAK. Более длительные курсы, до 120 минут, не показали дальнейшего изменения активности SLK, возможно, из-за того, что оборот адгезии достиг стабильного уровня.Подтверждая эти наблюдения, siRNA-опосредованный нокдаун SLK в мигрирующих монослоях (2 часа после ранения) привел к увеличению плотности и размера винкулин-положительных спаек (рис. 5A – D), предполагая, что отсутствие SLK может приводят к стабилизации адгезии. Интересно, что мы не смогли наблюдать каких-либо устойчивых различий в окраске фаллоидина после нокдауна SLK, что позволяет предположить, что нет никаких эффектов на динамику актиновых волокон или что они очень незначительны (рис. 5E – H). Вместе эти результаты подтверждают, что SLK-зависимые сигналы необходимы для обеспечения зависимого от микротрубочек оборот фокальной адгезии.

Рисунок 4. SLK необходим для микротрубочки-зависимого оборота адгезии.

Субконфлюентные фибробласты MEF 3T3 инфицировали аденовирусными конструкциями (A), кодирующими киназно-дефектный SLK (AdHA-KΔC) или контроль AdGFP, или трансфицировали (B) миРНК SLK (или siControl). Затем культуры обрабатывали нокодазолом (10 мкМ) в течение 4 часов, промывали и исследовали на уровни FAK-pTyr397 с течением времени. Экспрессию HA-меченного SLK или нокдауна SLK подтверждали Вестерн-блоттингом. Нокдаун SLK или экспрессия киназодефицитного SLK препятствует обмену фокальной адгезии, о чем свидетельствует отсроченное исчезновение FAK-pTyr397.(C) Состояние микротрубочек и pFAK-Y-397 оценивали после вымывания нокодазолом в присутствии или в отсутствие экспрессии shSLK. После отмывки в экспрессирующих shSLK клетках все еще можно было наблюдать большие адгезии. (D) Анализ киназы SLK in vitro, показывающий индукцию киназной активности после вымывания нокодазолом, как описано в A и B. Масштабная шкала 10 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0001868.g004

Рис. 5. Нокдаун SLK приводит к стабилизации адгезии.

Монослои MEF3T3 на FN были инфицированы аденовирусом, экспрессирующим shSLK или shScramble control, и поцарапаны. Через 2 часа клетки фиксировали и окрашивали на SLK (A, C, E и G) в комбинации с винкулином (B и D) или фаллоидином (F и H). В дополнение к уменьшенному окрашиванию SLK, клетки, экспрессирующие shSLK, не показали иммунореактивности SLK на переднем крае с повышенным количеством очаговых спаек. В образцах, окрашенных фаллоидином, явных различий не наблюдалось. Шкала шкалы 10 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0001868.g005

Активация и распространение SLK требует передачи сигналов FAK / src / MAPK

Сборка и активация комплекса FAK / c-src во время клеточной подвижности, по-видимому, необходима для эффективного обмена фокальной адгезии [5], [7], [27]. Кроме того, активированный комплекс FAK / c-src может рекрутировать множественные сигнальные адаптеры и активировать нисходящую передачу сигналов несколькими путями [2], [3], [28] — [31]. Активация SLK после царапин на монослоях, по-видимому, является относительно поздним событием (60 мин; фиг. 2), предполагая, что перед активацией SLK может быть необходима восходящая передача сигналов.Из-за конечной потребности в комплексе FAK-c-src при миграции клеток, мы проверили, требуются ли киназы семейства src или FAK для активации SLK в анализе царапин на ране.

Чтобы проверить участие киназ семейства src в регуляции SLK, монослои предварительно обрабатывали ингибитором семейства Src PP2 (или контроль PP3), а затем подвергали ранению в присутствии ингибитора. Как показано на фиг. 6A, обработка контрольным PP3 привела к активации SLK через 60 минут после царапины.Интересно, что обработка PP2 приводила к увеличению активности SLK в сливающихся монослоях без царапин, которая не могла быть увеличена путем ранения. Аналогичные результаты были получены в клетках SYF и восстановлены при экспрессии c-src (не показано). Это предполагает, что киназы семейства src необходимы для негативной регуляции активности SLK. Подтверждая это, наши предыдущие результаты показали, что избыточная экспрессия v-src ингибирует активность киназы SLK зависимым от CKII образом [32].

Рисунок 6.Активация SLK требует передачи сигналов FAK / src / MAPK.

(A) Конфлюентные монослои MEF 3T3 предварительно инкубировали (60 мин) с ингибиторами, а затем царапали раны в присутствии ингибиторов. Клетки собирали через 60 минут и анализировали на активность киназы SLK. (A) Обработка контрольным PP2 или PP3. (B) FAK-нулевые клетки или клетки дикого типа подвергали анализу царапин на ранах, как указано выше, и анализировали на активность SLK. (C) Обработка U0126 и контроль ДМСО. Фосфо-Erk1 / 2 показан в качестве контроля для обработки U0126.Активация SLK требует передачи сигналов FAK / src / MAPK.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0001868.g006

Для исследования роли FAK в регуляции SLK были проведены анализы царапин на фибробластах FAK (- / -) и контроле дикого типа. После повреждения монослоев FAK дикого типа активность киназы SLK повышается до уровней, сравнимых с уровнем клеток MEF3T3 (фиг. 6В). Однако после ранения FAK-нулевых монослоев наблюдалась небольшая повышающая регуляция SLK или ее отсутствие (фигура 6В), предполагая, что необходима передача сигналов адгезии и что активация SLK не является вторичным эффектом ранения монослоя.Точно так же царапины в присутствии ингибитора MEK1 U0126 предотвращали активацию SLK по сравнению с контролем DMSO (фигура 6C). В то же время царапины приводили к фосфорилированию ERK1 / 2, тогда как оно заметно снижалось в присутствии U0126 (рисунок 6C). Подобные эксперименты в присутствии ингибитора p38 SB203580 не показали влияния на активацию SLK (не показано). В целом, эти результаты предполагают, что активация SLK за счет подвижности, индуцированной царапинами, требует сигнальной системы FAK / c-src / MAPK.

Распространение клеток и царапины на монослоях фибробластов приводят к привлечению части белка SLK на периферии клетки или на переднем крае соответственно (рис. 1 и [13]). Было показано, что динамика и стабильность микротрубочек регулируются с помощью киназ семейства src в различных системах, включая стабилизацию с помощью интегрин-опосредованной передачи сигналов FAK [33] — [36]. Поэтому мы исследовали, зависит ли рекрутирование SLK на передний край от FAK / c-src. Монослои FAK-null или SYF (тройной нокаут src / yes / fyn), а также контроли дикого типа были ранены царапинами и совместно иммуноокрашены на SLK и Rac1.Хотя FAK-нулевые клетки не мигрируют эффективно, SLK был обнаружен вместе с Rac1 на переднем крае (рисунок 7C – D). Аналогичным образом SLK и Rac1 были задействованы в складках и переднем крае в клетках, обработанных U0126 (фиг. 7E и F). Однако мало или совсем не SLK можно было обнаружить на переднем крае поврежденных монослоев SYF (рис. 7G – H). Точно так же в этих клетках нарушалось распределение Rac1. Распределение как Rac1, так и SLK восстанавливается, когда c-src повторно экспрессируется в клетках SYF, указывая тем самым, что экспрессии c-src достаточно для рекрутирования SLK на переднем крае мигрирующих клеток.

Рисунок 7. Набор SLK в ведущую роль зависит от c-src.

Конфлюэнтные монослои клеток FAK дикого типа (A – B), FAK-null (C – D), SYF + c-src (E – F) и SYF (G – H) были ранены царапинами и иммуноокрашены на SLK и Rac1. Точно так же монослои MEF3T3 были предварительно обработаны U0126 (30 мин), поцарапаны и окрашены на SLK и Rac1 (I и J). SLK и Rac1 не удалось привлечь к переднему фронту в ячейках SYF. Шкала шкалы 10 мкм

https://doi.org/10.1371 / journal.pone.0001868.g007

Discussion

Наши предыдущие исследования показали, что SLK совместно локализуется с vinculin и Rac1 в складках мембран и ламеллиподиях распространяющихся фибробластов [13]. Кроме того, мы показали, что SLK может косвенно ассоциироваться с сетью микротрубочек и обеспечивать растворение актиновых стрессовых волокон Rac1-зависимым образом [13]. Здесь мы показываем, что SLK может быть совместно локализован с паксиллином, α-тубулином и Rac1 на переднем крае мигрирующих клеток и что его активность повышается за счет царапин на монослоях фибробластов.Снижение уровней или активности SLK отрицательно влияет на миграцию клеток и оборот фокальной адгезии, зависящий от микротрубочек, предполагая, что SLK необходим для подвижности клеток. Миграция клеток посредством монослойного ранения стимулирует активность SLK зависимым от передачи сигналов FAK / src / MAPK образом. Кроме того, для эффективного рекрутирования SLK на передний край мигрирующих клеток требуется c-src.

В целом, наши данные позволяют предположить, что SLK является важным регулятором динамики фокальных спаек / контактов. Активация и рекрутирование SLK на переднем крае мигрирующих клеток может быть необходимо для дестабилизации фокальных контактов, процесса, необходимого для дальнейшей протрузивной активности и подвижности [2], [17], [23], [37].Фокальная адгезия / контактная разборка д. Также дестабилизировать актиновую сеть, фенотип, как ранее сообщалось, индуцируется сверхэкспрессией SLK [11], [13].

Сеть микротрубочек, как было показано, тесно связана с клеточной адгезией и подвижностью [26], [36], [38]. Сообщалось, что микротрубочки нацелены на фокальные контакты, чтобы изменить их характеристики, включая их разборку [21], [39]. Кроме того, сеть микротрубочек стабилизируется с помощью передачи сигналов FAK и Rho GTPase на переднем крае мигрирующих клеток [36], [40], [41].Ассоциация SLK с микротрубочкой и ее потребность в эффективном обороте фокальной адгезии предполагает, что это новый ассоциированный с микротрубочкой сигнал, необходимый для миграции клеток.

Интересно, что ингибирование киназ семейства src с помощью PP2 приводит к усилению активности SLK в сливающихся монослоях без царапин, указывая тем самым, что киназы семейства src негативно регулируют SLK (см. Фиг. 6), что облегчается обработкой PP2. Следовательно, SLK не может быть далее активирован ранением.Подтверждая это, мы ранее показали, что SLK не фосфорилируется тирозином и что избыточная экспрессия v-src приводит к подавлению регуляции SLK посредством казеинкиназы II [32]. Хотя он не может быть активирован, SLK все же может быть задействован в переднем фронте ячеек с нулевым значением FAK. Однако рекрутирование SLK в эти структуры нарушено в клетках SYF (см. Фиг. 6).

Одна возможность состоит в том, что начальное рекрутирование и активация c-src во время сборки фокальных контактов [42] — [46] рекрутирует сеть микротрубочек и SLK.Наши предыдущие результаты показывают, что src может активировать CKII, что ведет к прямому подавлению SLK (32). Следовательно, возможно, что SLK остается неактивным до тех пор, пока киназы семейства src не будут подавлены. После последующей инактивации c-src с помощью csk или протеинфосфатаз [47] — [49] активность SLK может быть повышена посредством пути MAPK (рисунок 8). Поскольку рекрутирование SLK на передний край происходит в FAK-null, но не в SYF клетках, вполне вероятно, что рекрутирование микротрубочек посредством c-src не зависит от FAK.Одна возможность состоит в том, что в FAK (- / -) клетках некоторые аспекты сигнального комплекса Pyk2 / c-src могут компенсировать потерю FAK при рекрутировании SLK [4], [50]. Однако Pyk2 не может заменять FAK, который, по-видимому, необходим для активации SLK через MAP-киназозависимый путь [31].

Рис. 8. Модель активации и набора SLK на переднем крае.

Часть SLK связана с микротрубочками, вероятно, через белок, связывающий микротрубочки. После активации комплекса FAK / c-src может быть задействована сеть микротрубочек, а также активация каскада MAPK.Передача сигналов через CKII с помощью активного src может удерживать SLK в неактивном состоянии (32) до тех пор, пока инактивация src не может происходить через csk и другие фосфатазы. Комбинированная активация MAPK и подавление CKII может способствовать активации SLK. Остается выяснить, рекрутируется ли SLK до его активации или требуется ли подавление CKII для MAPK-опосредованной активации SLK. Этот каскад в конечном итоге приведет к обороту адгезии за счет дестабилизации актиновой сети или фокальных контактов / адгезий посредством неизвестного механизма.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0001868.g008

В целом наши данные показывают, что SLK активируется посредством передачи сигналов FAK / c-src / MAPK во время миграции клеток. Его рекрутирование на передний край в зависимости от c-src требуется для оборота фокальной адгезии. Происходит ли активация SLK до рекрутирования или после подавления c-src, пока неясно. Сходным образом, опосредуется ли это прямым фосфорилированием MAPK или другими MAPK-зависимыми событиями, еще предстоит выяснить.Сходным образом неизвестно, влияют ли члены семейства Rho GTPases на активацию или рекрутирование SLK или на его способность дестабилизировать актин. Идентификация субстратов SLK или нижестоящих сигнальных систем будет способствовать нашему пониманию роли SLK в миграции клеток.

Материалы и методы

Клеточные культуры и анализы миграции

Клетки MEF 3T3 дикого типа, FAK (- / -) и SYF (src / fyn / yes тройной мутант) поддерживали в MEM, модифицированном Дульбекко (DMEM, Gibco), с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS, Gibco), 2 мМ L-глутамин (Gibco) и пенициллин G (200 U мл ^-1 , Gibco) в увлажненном инкубаторе 37 ° C при 5% CO ₂ .Для анализа миграции клетки MEF 3T3 либо инфицировали аденовирусом, либо обрабатывали контрольными миРНК или siRNA SLK и оставляли сыворотку на голодании в течение ночи (DMEM + 0,5% FBS). Затем клетки (1–3 × 10 ⁴ ) ресуспендировали в среде DMEM, содержащей 0,5% БСА, и добавляли в верхнюю часть камеры для трансвелл-миграции Бойдена, предварительно покрытой фибронектином (10 мкг мл ^-1 ), и позволяли мигрировать в течение 3–6 часов. Остаточные клетки удаляли из верхней части камеры, и фильтр промывали PBS, фиксировали в 4% PFA в течение 10 минут и окрашивали DAPI (0.5 мкг мл ^-1 , Sigma). Клетки, которые мигрировали к нижней стороне фильтра, были подсчитаны от 5 до 10 случайных полей с использованием флуоресценции DAPI. Подсчет клеток проводили в трех повторностях для трех независимых экспериментов. Показаны репрезентативные эксперименты. Для закрытия раны слившиеся монослои царапали кончиком пипетки, и% закрытия оценивали через 12 часов как среднее остаточное расстояние между двумя мигрирующими фронтами на начальном расстоянии в нулевой момент времени. Было записано десять независимых измерений вдоль раны.

Миграцию, вызванную царапинами, выполняли, как описано [19]. Вкратце, клетки MEF 3T3 высевали на покрытые фибронектином чашки (10 мкг мл ^-1 ) и конфлюэнтные монослои, лишенные сыворотки, затем царапали кончиком пипетки до тех пор, пока примерно 50% монослоя не было удалено. Затем клетки промывали PBS, добавляли и собирали в различные моменты времени. В некоторых экспериментах монослои предварительно инкубировали в течение 60 минут с 10 мкМ PP3, PP2 (EMD-Calbiochem) или U0126 (Cell Signaling) и царапали раны в присутствии ингибиторов или контроля DMSO.Для анализов оборота адгезии, зависимой от микротрубочек [25], лишенные сыворотки субконфлюэнтные клетки MEF 3T3 обрабатывали 10 мкМ нокодазолом в течение 3 часов. Затем культуры промывали 4 раза бессывороточной средой и добавляли DMEM / 0,5% FBS в течение всего периода времени. Культуры собирали в разные моменты времени и исследовали на pFAK-Tyr397 (BioSource) с помощью вестерн-блоттинга.

SiRNA Knockdown и аденовирусные инфекции

Клетки MEF 3T3, высеянные с плотностью 1–3 × 10 ⁵ на чашки диаметром 60 мм, трансфицировали дуплексом 5 или 10 пМ siRNA SLK (Dharmacon) (5′-GGUUGAGAUUGACAUAUUA) с использованием реагента для трансфекции липофектамина 2000 (Gibco) согласно рекомендации производителей.В некоторых экспериментах клетки инфицировали аденовирусным вектором, экспрессирующим шпилечную РНК супрессора SLK (psiStrike; Promega), которая состояла из той же последовательности siRNA. Клетки собирали через 48 часов после трансфекции и анализировали на миграцию клеток во вставках из лунок и экспрессию белка с помощью вестерн-блоттинга. Контрольные миРНК состояли из нецелевого дуплекса Dharmacon. Аналогичные результаты были получены для скремблированных миРНК SLK. Чтобы контролировать влияние SLK с дефицитом киназы на миграцию клеток, использовали аденовирусные векторы, экспрессирующие SLK, неактивные к киназе (HA-KΔC: aa 1–373 с мутацией сайта связывания АТФ; Lys 63–> Arg) или контрольные (GFP или LacZ). используется для заражения культур MEF 3T3 [13].Клетки инфицировали при MOI 10 путем добавления аденовируса непосредственно к клеткам в 0,25% FBS-DMEM за 16 часов до анализа миграции. Экспрессию конструкций SLK подтверждали иммуноблоттингом против НА. Экспрессию LacZ и GFP подтверждали иммуноблотингом с антителом против бета-галактозидазы (Promega) и эпифлуоресценцией, соответственно. Экспрессию GFP подтверждали в живых клетках эпифлуоресценцией.

Антитела и иммунофлюоресценция

В этих исследованиях использовались следующие первичные антитела: поликлональные антитела SLK были такими, как описано ранее [15].Фосфо-GSK3β (ser 9) и GSK3β (передача сигналов), фосфо-FAK (Y397) (Biosource) и общий FAK (Санта-Крус), паксиллин (лаборатория трансдукции BD), α-тубулин (Sigma), Rac1 (Санта-Крус) и фосфор ERK1 / 2 и общий Erk1 / 2 (Санта-Крус), паксиллин (BD Transduction labs), α-тубулин (Sigma) и Rac1 (Санта-Крус) были получены из коммерческих источников. Тетраметилродамина изотиоцианат (TRITC) -фаллоидин был получен от Sigma.

Для исследований иммунофлуоресценции клетки MEF 3T3 помещали на покровные стекла, покрытые фибронектином (10 мкг / мл), и инкубировали в течение ночи.На следующий день монослои царапали и окрашивали через 2–4 ч. Вкратце, клетки промывали PBS, фиксировали в 4% PFA и блокировали в PBS, содержащем 5% козьей или ослиной сыворотки, в течение 20 минут. Добавляли свежий блокирующий раствор, содержащий первичные антитела, и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Антитела выявляли с помощью вторичных антител против мыши или кролика, конъюгированных либо с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), либо с TRITC (Sigma). Образцы визуализировали с помощью эпифлуоресцентного микроскопа Zeiss Axioscope100, снабженного соответствующими фильтрами, и фотографировали цифровой камерой (Sony Corporation HB050) с использованием программного пакета Northern Eclipse.

Вестерн-блоттинг, иммунопреципитация и киназные анализы

Клетки лизировали в буфере RIPA, как описано ранее [15], и лизаты очищали центрифугированием при 10000 g в течение 2 минут. Концентрации белка определяли с использованием красителя для анализа белка (Biorad). Равные количества белка (20–40 мкг) подвергали электрофорезу в 8% полиакриламидных гелях и переносили на мембрану из ПВДФ. Мембраны зондировали указанными антителами в течение ночи при 4 ° C в 5% BSA или сухом обезжиренном молоке в 1 × TBST (50 мМ Tris pH 7.4, 150 мМ NaCl, 0,05 Твин 20). Белки-мишени выявляли с помощью вторичных антител, связанных с пероксидазой хрена, в сочетании с хемилюминесценцией (Perkin Elmer) и воздействием рентгеновской пленки.

Для иммунопреципитации 300–400 мкг белкового лизата подвергали иммунопреципитации с 1–2 мкг антитела и 20 мкл сефарозы белка А (Pharmacia) в течение 2–12 часов. Иммунные комплексы выделяли центрифугированием и промывали буфером NETN (20 мМ Tris-HCl pH 8,0, 1 мМ EDTA, 150 мМ NaCl, 0,5% Nonidet P-40) и подвергали электрофорезу в SDS-полиакриламидном геле (PAGE) или киназному анализу. In vitro. Анализы SLK-киназы выполняли после иммунопреципитации SLK, как описано ранее [15]. Киназные реакции останавливали добавлением 7 мкл 4-кратного буфера для образца додецилсульфата натрия (SDS) и проводили электрофорез на 8% SDS-PAGE. Гели переносили на мембраны из PVDF и подвергали авторадиографии с последующим вестерн-блоттингом с антителом против SLK.

Вклад авторов

Проведенные эксперименты: SW PK MM. Проанализированы данные: LS SW KR.Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: ZC CS KR MM. Написал бумагу: LS SW.

Ссылки

1. 1. Mitra SK, Schlaepfer DD (2006) Регулируемая интегрином передача сигналов FAK-Src в нормальных и раковых клетках. Curr Opin Cell Biol 18: 516–523.
2. 2. Webb DJ, Parsons JT, Horwitz AF (2002) Сборка, разборка и оборот адгезии в мигрирующих клетках — снова и снова. Nat Cell Biol 4: E97–100.
3. 3. Brown MC, Turner CE (2004) Паксиллин: адаптация к изменениям.Physiol Rev 84: 1315–1339.
4. 4. Sieg DJ, Hauck CR, Schlaepfer DD (1999) Необходимая роль киназы фокальной адгезии (FAK) для миграции клеток, стимулированной интегрином. J. Cell Science 112: 2677–2691.
5. 5. Хамади А., Буали М., Донтенвилл М., Стокель Х., Такеда К. и др. (2005) Регулирование динамики и разборки очаговой адгезии путем фосфорилирования FAK по тирозину 397. J Cell Sci 118: 4415–4425.
6. 6. Ren XD, Kiosses WB, Sieg DJ, Otey CA, Schlaepfer DD и др.(2000) Киназа фокальной адгезии подавляет активность Rho, способствуя обновлению фокальной адгезии. J Cell Sci 113 (Pt 20): 3673–3678.
7. 7. Webb DJ, Donais K, Whitmore LA, Thomas SM, Turner CE и др. (2004) передача сигналов FAK-Src посредством паксиллина, ERK и MLCK регулирует разборку адгезии. Nat Cell Biol 6: 154–161.
8. 8. Каплан К. Б., Биббинс К. Б., Сведлоу Дж. Р., Арно М., Морган Д. О. и др. (1994) Ассоциация аминоконцевой половины c-Src с фокальными адгезиями изменяет их свойства и регулируется фосфорилированием тирозина 527.Embo J 13: 4745–4756.
9. 9. Fincham VJ, Frame MC (1998) Каталитическая активность Src необязательна для транслокации к фокальным адгезиям, но контролирует оборот этих структур во время подвижности клеток. Embo J 17: 81–92.
10. 10. Schaar DG, Varia MR, Elkabes S, Ramakrishnan L, Dreyfus CF и др. (1996) Идентификация новой кДНК, преимущественно экспрессирующейся в обонятельно-лимбической системе взрослой крысы. Brain Res 721: 217–228.
11. 11.Sabourin LA, Tamai K, Seale P, Wagner J, Rudnicki MA (2000) Расщепление каспазой 3 связанной с Ste20 киназы SLK высвобождает и активирует индуцирующий апоптоз киназный домен и актин-дизассемблирующую область. Mol Cell Biol 20: 684–696.
12. 12. Сабурин Л.А., Рудницкий М.А. (1999) Индукция апоптоза SLK, киназой, связанной с Ste20. Онкоген 18: 7566–7575.
13. 13. Wagner S, Flood TA, O’Reilly P, Hume K, Sabourin LA (2002) Ассоциация Ste20-подобной киназы (SLK) с микротрубочкой.Роль в Rac1-опосредованной регуляции динамики актина во время клеточной адгезии и распространения. J Biol Chem 277: 37685–37692.
14. 14. Сторбек С.Дж., Даниэль К., Чжан Ю.Х., Лунде Дж., Шайм А. и др. (2004) Ste20-подобная киназа SLK проявляет специфичность типа миофибрилл и участвует в дифференцировке миобластов C2C12. Мышечный нерв 29: 553–564.
15. 15. O’Reilly PG, Wagner S, Franks DJ, Cailliau K, Browaeys E, et al. (2005) Ste20-подобная киназа SLK необходима для прохождения клеточного цикла через G2.J Biol Chem 280: 42383–42390.
16. 16. Hao W, Takano T, Guillemette J, Papillon J, Ren G и др. (2006) Индукция апоптоза Ste20-подобной киназой SLK, киназой зародышевого центра, которая активирует киназу, регулирующую сигнал апоптоза, и p38. J Biol Chem 281: 3075–3084.
17. 17. Schlaepfer DD, Mitra SK (2004) Множественные связи связывают FAK с подвижностью и инвазией клеток. Curr Opin Genet Dev 14: 92–101.
18. 18. Schlaepfer DD, Hauck CR, Sieg DJ (1999) Передача сигналов через киназу фокальной адгезии.Prog Biophys Mol Biol 71: 435–478.
19. 19. Etienne-Manneville S, Hall A (2001) Интегрин-опосредованная активация Cdc42 контролирует клеточную полярность в мигрирующих астроцитах через PKCzeta. Ячейка 106: 489–498.
20. 20. Etienne-Manneville S, Hall A (2003) Cdc42 регулирует GSK-3beta и аденоматозный полипоз кишечной палочки для контроля полярности клеток. Природа 421: 753–756.
21. 21. Каверина И., Крылышкина О., Смолл Ю. В. (1999) Нацеливание микротрубочек на контакты субстрата способствует их релаксации и диссоциации.J Cell Biol 146: 1033–1044.
22. 22. Брантон В.Г., Авизиените Э., Финчем В.Дж., Серрелс Б., Меткалф К.А., 3-й и др. (2005) Идентификация Src-специфического сайта фосфорилирования на киназе фокальной адгезии: анализ роли Src Sh3 и каталитических функций и их последствий для поведения опухолевых клеток. Cancer Res 65: 1335–1342.
23. 23. Schwartz MA, Horwitz AR (2006) Интеграция адгезии, выпячивания и сокращения во время миграции клеток. Ячейка 125: 1223–1225.
24. 24. Каверина И., Крылышкина О., Смолл Ю. В. (2002) Регулирование динамики адгезии субстрата при подвижности клеток. Inter J Biochem Cell Biol. 34: 746–761.
25. 25. Ezratty EJ, Partridge MA, Gundersen GG (2005) Индуцированная микротрубочками разборка фокальной адгезии опосредуется динамином и киназой фокальной адгезии. Nat Cell Biol. 7: 581–590.
26. 26. Бершадский А., Чаусовский А., Беккер Е., Любимова А., Гейгер Б. (1996) Участие микротрубочек в контроле адгезивно-зависимой передачи сигнала.Curr Biol 6: 1279–1289.
27. 27. Брантон В.Г., Макферсон И.Р., Фрейм М.С. (2004) Рецепторы клеточной адгезии, тирозинкиназы и модуляторы актина: сложная трехсторонняя схема. Biochim Biophys Acta 1692: 121–144.
28. 28. Mitra SK, Hanson DA, Schlaepfer DD (2005) Киназа фокальной адгезии: в команде и контроле подвижности клеток. Nat Rev Mol Cell Biol 6: 56–68.
29. 29. Schaller MD, Parsons JT (1994) Киназа фокальной адгезии и ассоциированные белки.Curr Opin Cell Biol 6: 705–710.
30. 30. Schaller MD (2001) Паксиллин: адаптерный белок, связанный с фокальной адгезией. Онкоген 20: 6459–6472.
31. 31. Хуанг С., Якобсон К., Шаллер М.Д. (2004) MAP-киназы и миграция клеток. J Cell Sci 117: 4619–4628.
32. 32. Chaar Z, O’Reilly P, Gelman I, Sabourin LA (2006) v-Src-зависимое подавление Ste20-подобной киназы SLK казеинкиназой II. J Biol Chem 281: 28193–28199.
33. 33.Саймон Дж. Р., Графф Р. Д., Манесс П. Ф. (1998) Динамика микротрубочек в цитозольном экстракте головного мозга эмбриона крысы. J Neurocytol 27: 119–126.
34. 34. Laurent CE, Delfino FJ, Cheng HY, Smithgall TE (2004) Тирозинкиназа c-Fes человека связывает тубулин и микротрубочки через отдельные домены и способствует сборке микротрубочек 10.1128 / MCB.24.21.9351-9358.2004. Mol Cell Biol 24: 9351–9358.
35. 35. Сулименко В., Драберова Е., Сулименко Т., Мачурек Л., Рихтерова В. и др.(2006) Регулирование образования микротрубочек в активированных тучных клетках с помощью комплексов {гамма} -тубулина с киназами Fyn и Syk. J Immunol 176: 7243-7253.
36. 36. Palazzo AF, Eng CH, Schlaepfer DD, Marcantonio EE, Gundersen GG (2004) Локализованная стабилизация микротрубочек за счет передачи сигналов Rho, обеспечиваемой интегрином и FAK. Наука 303: 836–839.
37. 37. Small JV, Stradal T, Vignal E, Rottner K (2002) Ламеллиподиум: там, где начинается подвижность. Тенденции Cell Biol 12: 112–120.
38. 38. Enomoto T (1996) Нарушение микротрубочек вызывает образование актиновых стрессовых волокон и очаговых адгезий в культивируемых клетках: возможное участие сигнального каскада rho. Функция клеточной структуры 21: 317–326.
39. 39. Каверина И., Роттнер К., Смолл Дж. В. (1998) Нацеливание, захват и стабилизация микротрубочек при ранних фокальных сращениях. J Cell Biol 142: 181–190.
40. 40. Wittmann T, Bokoch GM, Waterman-Storer CM (2003) Регулирование динамики переднего края микротрубочек и актина ниже по течению от Rac1.J Cell Biol 161: 845–851.
41. 41. Cook TA, Nagasaki T, Gundersen GG (1998) Рогуанозинтрифосфатаза опосредует селективную стабилизацию микротрубочек, индуцированную лизофосфатидной кислотой. J Cell Biol 141: 175–185.
42. 42. Arthur WT, Petch LA, Burridge K (2000) Взаимодействие интегринов подавляет активность RhoA посредством c-Src-зависимого механизма. Curr Biol 10: 719–722.
43. 43. Ариас-Сальгадо EG, Lizano S, Sarkar S, Burgge JS, Ginsberg MH, et al.(2003) Активация киназы Src путем прямого взаимодействия с цитоплазматическим доменом интегрина {бета}. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 13298–13302.
44. 44. Schaller MD, Hildebrand JD, Parsons JT (1999) Образование комплекса с киназой фокальной адгезии; механизм регуляции активности и субклеточной локализации киназ Src. Molec Biol Cell 10: 3489–3505.
45. 45. Шаллер MD, Хильдебранд JD, Шеннон JD, Fox JW, Vines RR и др. (1994) Аутофосфорилирование киназы фокальной адгезии, pp125FAK, направляет Sh3-зависимое связывание pp60src.Mol Biol Cell 14: 1680–1688.
46. 46. Schlaepfer DD, Broome MA, Hunter T (1997) Стимулированная фибронектином передача сигналов от комплекса фокальной адгезии киназа-c-Src: участие адаптерных белков Grb2, p130 Cas и Nck. Mol Cell Biol 17: 1702–1713.
47. 47. Ренгифо-Кам В., Кониси А., Моришита Н., Мацуока Н., Ямори Т. и др. (2004) Csk определяет способность опосредованной интегрином клеточной адгезии и миграции в раковых клетках толстой кишки человека: значение потенциальной роли в метастазировании рака.Онкоген 23: 289–297.
48. 48. McGarrigle D, Shan D, Yang S, Huang XY (2006) Роль тирозинкиназы Csk в индуцированной G-протеин-рецептором и рецепторной тирозинкиназой миграции клеток фибробластов. J Biol Chem 281: 10583–10588.
49. 49. Анже-Лустау А., Кот Дж. Ф., Чарест А., Доубенко Д., Спенсер С. и др. (1999) Белковая тирозинфосфатаза-PEST регулирует разборку фокальной адгезии, миграцию и цитокинез в фибробластах. J Cell Biol 144: 1019–1031.
50. 50. Sieg DJ, Ilic D, Jones KC, Damsky CH, Hunter T. и др. (1998) Pyk2 и протеин-тирозинкиназы семейства Src компенсируют потерю FAK в событиях передачи сигналов, стимулированных фибронектином, но Pyk2 не полностью функционирует для усиления миграции FAK-клеток. Embo J 17: 5933–5947.

Процветающий бизнес фейковых просмотров на YouTube

Мартин Василев зарабатывает себе на жизнь продажей фейковых просмотров видео на YouTube. Работая из дома в Оттаве, он продал в этом году около 15 миллионов просмотров, что позволило ему заработать более 200 000 долларов, как показывают отчеты.

Г-н Василев, 32 года, сам не предоставляет обзоры. Его веб-сайт 500Views.com связывает клиентов со службами, предлагающими просмотры, симпатии и антипатии, созданные компьютерами, а не людьми. Когда поставщик не может выполнить заказ, г-н Василев — как современный оператор коммутатора — быстро подключается к другому.

«Я могу обеспечить неограниченное количество просмотров видео», — сказал г-н Василев в интервью.«Они столько лет пытались остановить это, но не могут это остановить. Всегда есть выход «.

После Google больше людей ищут на YouTube, чем на любом другом сайте. Согласно исследованию Pew Research Center, проведенному в 2018 году, это самая популярная платформа среди подростков, опережая таких гигантов, как Facebook и Instagram. Этот видеосайт с миллиардами просмотров в день помогает стимулировать мировые культурные сенсации, способствовать развитию карьеры, продавать бренды и продвигать политические программы.

Подобно тому, как другие социальные сети страдают от самозваных аккаунтов и искусственных кампаний влияния, YouTube уже много лет борется с фальшивыми просмотрами.

Экосистема фальшивых просмотров, частью которой является Василев, может подорвать доверие к YouTube, манипулируя цифровой валютой, которая сигнализирует о ценности для пользователей. Хотя YouTube утверждает, что фальшивые просмотры составляют лишь крошечную долю от общего числа, они по-прежнему оказывают значительное влияние, вводя в заблуждение потребителей и рекламодателей.Опираясь на десятки интервью, отчеты о продажах и пробных покупках мошеннических просмотров, The New York Times изучила, как работает рынок, и проверила способность YouTube обнаруживать манипуляции.

Завышение количества просмотров нарушает условия использования YouTube. Но поисковые запросы Google с целью покупки просмотров приводят к появлению сотен сайтов, предлагающих «быстрые» и «простые» способы увеличить количество видео на 500, 5000 или даже пять миллионов. Сайты, предлагающие просмотры всего за гроши каждый, также появляются в поисковой рекламе Google.

Для проверки сайтов репортер Times заказал тысячи просмотров у девяти компаний. Почти все покупки, сделанные для видео, не связанных с новостной организацией, были выполнены примерно за две недели.

Одним из предприятий был Devumi.com. Согласно отчетам компании, за три года он собрал более 1,2 миллиона долларов, продав 196 миллионов просмотров на YouTube. Практически все виды остались сегодня.Анализ этих записей с 2014 по 2017 год показывает, что большинство заказов было выполнено в течение нескольких недель, хотя для миллиона просмотров и более требовалось больше времени. Недорогое и быстрое предоставление больших объемов часто является признаком того, что услуга не предлагает реальной аудитории.

При покупке просмотры были длиннее

Майкл Х. Келлер | Источник: YouTube Analytics

Devumi были сотрудник RT, медиа-организации, финансируемой правительством России, и сотрудник Al Jazeera English, другой компании, поддерживаемой государством.Другими покупателями были кинорежиссер, работавший на консервативную группу политических интересов «Американцы за процветание», и руководитель отдела видеонаблюдения в The New York Post. (Аль-Джазира и The Post заявили, что работникам не разрешено совершать такие покупки, и они больше не работают там.)

Несколько музыкантов покупали просмотры, чтобы казаться более популярными: просмотры на YouTube учитываются в показателях рейтингового агентства Nielsen и хит-парадах песен, включая Billboard’s Hot 100.

Некоторые компании покупали просмотры для клиентов, обещая продвижение в социальных сетях, в результате чего их видео будут смотреть реальные люди.

78-летняя Джудит Оппенгеймер заплатила компании 5000 долларов за продвижение книги, которую она опубликовала самостоятельно, в надежде на получение массовой сделки. Ее видео вскоре набрало более 58 000 просмотров через Devumi.

«Не было роста продаж и продаж книг», — сказала она.«Вскоре после того, как я подписал контракт, я подумал:« У меня не будет доказательств того, что они делают или не делают ». Теперь это начинает обретать смысл. Они могут сделать это за день ».

Поставщики зависят от постоянно развивающейся тактики доставки просмотров, включая автоматический или «бот-трафик» и всплывающие видеоролики на компьютерах ничего не подозревающих пользователей, но YouTube утверждает, что у него есть эффективные процессы для защиты от этих подходов.

«Это проблема, над которой мы работали много-много лет», — сказала Дженнифер Фланнери О’Коннор, директор YouTube по управлению продуктами.По ее словам, системы компании постоянно отслеживают активность видео, и команда по борьбе с мошенничеством часто покупает просмотры, чтобы лучше понять, как работают эти сайты. «Наши системы обнаружения аномалий действительно хороши».

Тем не менее, проблемы значительны. В какой-то момент в 2013 году на YouTube было столько же трафика от ботов, маскирующихся под людей, сколько от реальных посетителей, по данным компании. Некоторые сотрудники опасались, что это приведет к сбою системы обнаружения мошенничества, классифицируя поддельный трафик как реальный и наоборот — перспективные инженеры назвали это «инверсией».”

«Проблема была необычной», — сказал Блейк Ливингстон, в то время член группы YouTube по борьбе с мошенничеством и злоупотреблениями, который с тех пор покинул компанию.

Но были внесены исправления, которые уменьшили всплеск фейкового трафика, который, по словам YouTube, был результатом атаки на веб-сайт.

Спустя годы борьба с фейковыми просмотрами продолжается, даже несмотря на то, что YouTube борется с кампаниями по дезинформации, такими как усилия России во время выборов 2016 года, и с языком ненависти, в том числе с сообщениями недавно запрещенного сайта Infowars.

YouTube не стал раскрывать количество блокируемых им фейковых просмотров каждый день, но сообщил, что его команды работали над тем, чтобы их количество составляло менее 1 процента от общего числа. Тем не менее, с платформой, регистрирующей миллиарды просмотров в день, десятки миллионов фальшивых просмотров могут просматриваться ежедневно.

«Манипуляции с подсчетом просмотров будут проблемой, пока просмотры и известная ими популярность являются валютой YouTube», — сказал г-н.- сказал Ливингстон.

Г-ну Василеву потребовалось около 18 месяцев, чтобы пройти путь от получения пособия и проживания со своим отцом в Канаде до покупки белого BMW 328i и собственного дома.

К концу 2014 года его веб-сайт был на первой странице результатов поиска Google по покупке просмотров на YouTube, выполняя от 150 до 200 заказов в день и принося более 30 000 долларов в месяц, сказал он.«Я действительно не мог поверить, что можно заработать столько денег в Интернете, — сказал он. Заказ репортера Times на своем сайте на 25 000 просмотров был выполнен днем ​​позже.

Представитель Google, который принадлежит той же компании, что и YouTube, заявила, что сайты, продающие просмотры, появляются в результатах поиска, потому что они релевантны, но что есть «возможности для улучшения» в предупреждении пользователей.

г.Василев отказался назвать своих клиентов, но сказал, что много заказов поступило от фирм по связям с общественностью или маркетинговых фирм.

Сегодня он выполняет большинство заказов через SMMKings.com, оптового поставщика, которым управляет 29-летний Шон Тамир. Г-н Тамир взимает с него около доллара за тысячу просмотров, которые г-н Василев перепродает за 13,99 доллара, добавив 100 бесплатных лайков.

Несколько раз в год YouTube вносит изменения в свою систему обнаружения, чтобы попытаться предотвратить фальшивые просмотры, г-н.- сказала Тамир. Недавний эпизод произошел в конце января, но многие сайты работали несколько недель спустя, когда The Times совершила большую часть своих покупок. Поставщики говорят, что они обходят обновления системы, делая свой трафик более человечным, например, гарантируя, что он исходит от пользователей с предыдущими просмотрами.

Один поставщик, 24-летний Карлтон Э. Байнум II, использует рекламу для привлечения клиентов. В этом году он собрал более 191 000 долларов дохода, но, согласно финансовым отчетам, потратил более 109 000 долларов на рекламу, которая появлялась в топе Google.Его сайт GetLikes.click, запущенный из домашнего офиса в Хьюстоне, продает просмотры на YouTube, а также подписчиков в Instagram и Twitter, лайки в Facebook и игры SoundCloud.

Google не разрешает рекламу с такими словами, как «покупать просмотры на YouTube». Но г-н Байнум сказал, что одним из способов обхода проблемы является неправильное написание слов и отправка объявления несколько раз, если сначала в нем было отказано. Когда его спросили о рекламе платных просмотров на YouTube, Google удалил часть рекламы, в том числе Mr.Bynum’s, но похожие вернулись через две недели.

Перед тем, как мистер Байнум продавал просмотры, он покупал их для себя. После того, как в прошлом году его уволили из морской пехоты, он начал публиковать обзоры продуктов на YouTube и получать скидку, когда посетители совершали покупки по его ссылкам. По его словам, просмотры, которые он покупал, часто приводили к тому, что его видео занимали более высокое место в поиске, чем его конкуренты. Эффект будет снежным комом: его видео получат трафик через поиск, и он будет зарабатывать больше денег.(Представитель YouTube заявила, что просмотры были лишь одним из многих факторов, влияющих на поисковый рейтинг.)

«Это сработало отлично», — сказал он. «Я могу получить просмотры в течение дня. Я могу получать лайки в течение нескольких часов ».

Г-н Байнум сказал, что, по его мнению, его видео смотрят реальные люди. «Но, допустим, есть небольшая вероятность, что я ошибаюсь, и это боты», — сказал он. «Их видео все еще получают рейтинг».

г.Василев, который также сказал, что использовал фальшивые просмотры для повышения поискового рейтинга видео, продвигающих его веб-сайт, не претендует на то, что то, что он продает, является подлинной аудиторией. «Это невозможно, — сказал он.

Продавец по телефону сказал, что это будет просто: Элизабет Клейтон, бывший профессор английского языка и психологии, могла бы заплатить Hancock Press 4200 долларов за публикацию своих самостоятельно опубликованных стихотворных произведений.Компания заявила, что онлайн-продвижение, включая 40 000 гарантированных просмотров на YouTube, приведет к продажам, как показывают электронные письма.

Г-жа Клейтон, 77 лет, была настроена оптимистично. Она издала семь лет, но мало что продала. Один чек на гонорар составил 1,47 доллара, другой — 0,75 доллара. Она подписалась на Hancock для продвижения двух видео, которые, как показывают записи, обошлись ей в 8 400 долларов.

«Мне сказали, что если я получу определенное количество просмотров, я продам определенное количество», — сказала она.

Вместо традиционного маркетинга, Хэнкок заплатил 270 долларов за 55 000 просмотров от Devumi за каждое видео, как показывают записи. В итоге количество просмотров достигло около 60 000, где они и остались. Но роста продаж не было. «Они ничего не могли сказать мне о людях, которые смотрели видео», — сказала г-жа Клейтон. «Я что-то подозревал, но не мог получить никакой информации».

Уэйн Хэнкок, 92-летний исполнительный директор компании из Арканзаса, сказал, что, по его мнению, видео смотрят реальные люди.Вот как Девуми продвигала свои взгляды. Дочь г-на Хэнкока, К. С. Шэй, которая помогает вести бизнес, отклонила документы г-жи Клейтон и квитанции Devumi как подделку.

Но записи Devumi показывают, что Hancock Press потратила около 26 000 долларов за три года, получив более пяти миллионов просмотров для 75 или около того авторов. Интервью с шестью другими клиентами Хэнкок согласуются с опытом г-жи Клейтон.

Devumi не ответила на неоднократные запросы о комментариях.Компания, чей веб-сайт сообщает о закрытии, в январе попала под расследование в двух штатах после того, как The Times сообщила о продаже поддельных подписчиков в Twitter.

Многие клиенты Devumi пришли из музыкальной индустрии, где покупка просмотров является обычным делом и часто считается необходимой. «YouTube — один из основных источников потребления музыки и важный индикатор музыкальных тенденций и популярности», — сказал Сильвио Пьетролуонго, вице-президент Billboard.

Как новый художник, Алим Халид нанял Crowd Surf, рекламную компанию, в 2014 году. Без его ведома, по его словам, фирма купила по 10 000 просмотров каждого из трех его видео. Сейчас у них от 11 000 до 42 000 просмотров. «Самое прекрасное в этих платформах социальных сетей — это то, что когда они появились, они были подлинными. Но теперь я чувствую, что все это фальшивка », — сказал 25-летний г-н Халид (Кэсси Петри, соучредитель Crowd Surf, сказала, что, по ее мнению, Devumi производит реальные просмотры, основываясь на заявлениях на ее веб-сайте.)

Другие, которые полагались на Devumi, сказали, что они также были удивлены тактикой компании. Ами Горовиц, консервативный режиссер, купил 10 000 просмотров видео, в котором он появился — «Что мы узнали на народном климатическом марше» — на YouTube-канале организации «Американцы за процветание», группы политического влияния братьев Кох. Г-н Горовиц, который часто бывает в гостях на Fox News, также купил просмотры для видео о протестах в Фергюсоне, штат Миссури.

В своем заявлении он сказал, что считал, что Devumi работает как традиционная веб-реклама. Но «это было не то, что мы ожидали», — сказал он, добавив, что никогда больше не использовал Devumi или аналогичные сервисы. Представитель организации «Американцы за процветание» назвала такое поведение неэтичным и заявила, что группа «сознательно не будет участвовать» в этом.

Инженеры, статистики и специалисты по обработке данных YouTube постоянно совершенствуют свои способности бороться с тем, что г-жаО’Коннор называет «очень сложной проблемой», но атаки «постоянно становятся все сильнее и изощреннее», — сказала она.

После того, как репортер Times представил YouTube видео, для которых он купил просмотры, компания заявила, что продавцы использовали две уязвимости, которые уже были исправлены. Позже в тот же день репортер купил больше просмотров у шести тех же поставщиков. Количество просмотров снова увеличилось, хотя и медленнее. Через неделю все поставщики, кроме двух, доставили полную сумму.

Покупки с поддельным просмотром были в основном успешными

• Покупка успешна
• Неудачная

Майкл Х. Келлер | Источник: New York Times

Даже если присмотреться, YouTube может пропустить видео с фальшивыми просмотрами. В публичном отчете Google за 2017 год о дезинформации во время выборов 2016 года были проанализированы каналы RT на YouTube и сделан вывод об отсутствии «свидетельств манипулирования нашей платформой или нарушений политики».«Тем не менее, The Times недавно обнаружила, что сотрудник RT покупал фальшивые просмотры видео в 2016 году, которые, по признанию YouTube, не обнаруживались.

Джеймс Браун, корреспондент RT, приобрел 30 000 просмотров и 300 лайков для трех видеороликов, посвященных проблемам бездомности и иммиграции в Европе. Г-н Браун сказал, что он поймал Девуми на слове, что взгляды будут настоящими людьми. Представитель RT заявила, что компания не знала о покупках и проводила внутреннюю проверку.

«Меня беспокоит, что, хотя Twitter и Facebook, похоже, добились определенного прогресса в этой области, YouTube все еще пытается выявить недостоверную и скоординированную деятельность на своей платформе», — сказал сенатор Марк Уорнер из Вирджинии, главный демократ в Комитете по разведке.

Сайты, продающие просмотры, продолжают безнаказанно размещать рекламу. Сообщение в блоге авторов YouTube, предупреждающее пользователей о недопустимости фальшивых просмотров, содержит множество комментариев со ссылками на сайты, продающие просмотры.

«Единственный способ, которым YouTube может устранить это, — это полностью удалить счетчик просмотров», — сказал г-н Василев, продавец фальшивых просмотров. «Но это лишит YouTube цели».

Instagram убивает поддельных подписчиков, угрожает аккаунтам, которые продолжают использовать приложения для их получения — TechCrunch

Instagram борется с автоматическими приложениями, которые люди используют, чтобы оставлять спам-комментарии или подписываться, а затем отписываться от других в надежде на расширение своей аудитории.Сегодня Instagram удаляет из аккаунтов людей, использующих эти приложения, недостоверные подписки, лайки и комментарии, нарушающие его политику; отправив им предупреждение о смене пароля, чтобы разорвать связь с этими приложениями, и заявив, что люди, продолжающие использовать эти приложения, «могут столкнуться с проблемой, связанной с их работой в Instagram». Instagram сообщает мне, что «может ограничить доступ, например, к определенным функциям» для этих пользователей.

Instagram также надеется отговорить пользователей от предоставления другой компании данных для входа в свои учетные записи, поскольку это может привести к их взлому или использованию их учетной записи для рассылки спама.Таким образом, если вы видите, что учетные записи подписчиков в Instagram падают, это не потому, что этот профиль оскорбляет людей, а потому, что подписчики были фальшивыми. Возобновление политики принуждения происходит на фоне продолжающейся угрозы иностранных кампаний дезинформации в Facebook и Instagram, направленных на поляризацию сообществ и влияние на выборы в США и за рубежом. Facebook заявил, что неаутентичные учетные записи часто являются корнем этих кампаний, и только за последний квартал он удалил 754 миллиона поддельных учетных записей, и остановка этих спам-приложений может помешать им злоупотреблять учетными записями клиентов.Instagram удаляет поддельные аккаунты как минимум с 2014 года, но это первый раз, когда он публично обсуждает удаление поддельных лайков из сообщений. Теперь в нем говорится: «Мы создали инструменты машинного обучения, чтобы помочь идентифицировать аккаунты, которые используют [сторонние приложения для увеличения числа подписчиков], и удалить недостоверную активность».

Некоторые из самых популярных приложений-ботов для растущих подписчиков, такие как Instagress и Social Growth, были закрыты, но другие, такие как Archie, InstarocketProX и Boostio, берут от 10 до 45 долларов в месяц.Они часто заявляют, что не нарушают политику Instagram, хотя и делают. New York Times в этом году обнаружила, что многие известные знаменитости опустились до покупки поддельных подписчиков в Twitter у компании Devumi.

InstarocketProX рекламирует, как он берет под свой контроль вашу учетную запись, чтобы ставить лайки и подписываться на людей, чтобы обмануть их и заставить их подписаться обратно

Пользователи обычно должны предоставить свое имя пользователя и пароль этим службам, которые затем берут под свой контроль их учетные записи и автоматически ставят лайки, комментируют и подписываются на учетные записи, связанные с желаемыми хэштегами, чтобы заставить их последовать за недобросовестным пользователем.Пользователи спам-приложения теперь будут отруганы Instagram, который отправит «сообщение в приложении, предупреждающее их о том, что мы удалили недостоверные лайки, подписки и комментарии, предоставленные их учетной записью другим», и им будет предложено изменить свои пароли.

Однако один большой вопрос заключается в том, будет ли Instagram более жестко бороться с рекламой сервисов, продающих поддельных подписчиков, которые появляются в его приложении. Я замечал их в прошлом, и иногда они маскируются под аналитические приложения, помогающие влиятельным лицам отслеживать размер своей аудитории.Мы спросили Instagram, и представитель сказал нам: «На рекламу также распространяются наши стандарты сообщества, которые запрещают рассылку спама, такую ​​как сбор лайков, подписчиков и т. Д. — так что вы правы, что реклама этих услуг нарушает наши правила. Пожалуйста, не стесняйтесь сообщать о них, если вы их видите ».

аккаунтов подписчиков в таких приложениях, как Instagram, стали мерилом влияния, доверия и потенциального заработка людей. Это особенно актуально для звезд социальных сетей, которым платят за спонсорство бренда частично в зависимости от размера их аудитории.Теперь, когда бренды даже платят «наноинфлюенсерам» всего с тысячей подписчиков за публикацию спонсируемого контента, привлекательность использования этих услуг может быть высокой и привести к немедленной отдаче от незаконных инвестиций.

Если никто не может поверить в точность этих подсчетов, это ставит под сомнение легитимность Instagram. И каждый раз, когда вы получаете уведомление о фальшивом подписчике или лайке, оно отвлекает вас от реальной жизни, снижает качество разговора в Instagram и снижает вероятность того, что люди будут придерживаться приложения.Любой, кто готов платить за фальшивых подписчиков, не заслуживает вашего внимания, и Instagram не должен отказываться от закрытия своих аккаунтов, если они этого не сделают.

Киназа фокальной адгезии — обзор

Передача сигналов рецептора

CDAF, полученные из сигнала коллагена типа IV через семейство рецепторов интегрина. Предполагается, что аррестен передает сигнал через рецептор α1β1, ингибируя фосфорилирование фокальной киназы адгезии (FAK) и последующее ингибирование путей Raf / MEK / ERK1 / 2 и MAPK [5,19,20], тем самым регулируя множественные клеточные процессы, включая перестройки цитоскелета. , миграция, распространение и выживание.Интересно, что в то время как зрелый коллаген IV типа содержит мотив GFOGER, необходимый для связывания рецептора в нативной тройной спиральной конформации [21], arresten его не содержит. Тем не менее, рецептор α1β1 необходим для передачи сигналов arresten, поскольку было показано, что arresten не ингибирует рост опухоли и не индуцирует апоптоз как на моделях мышей с дефицитом интегрина α1, так и на различных линиях опухолевых клеток, в которых отсутствует рецептор α1β1 [20]. Кроме того, передача сигналов через α1β1 также регулирует миграцию макрофагов, экспрессию коллагена и ММР, фиброз и участвует в аутоиммунных и воспалительных заболеваниях [22,23], делая arresten многогранной молекулой.

Канстатин передает сигналы через рецепторы интегрина α3β1, αvβ3 и αvβ5 [24], хотя литература по конкретным сигнальным событиям немногочисленна. Подобно аррестену, канстатин ингибирует фосфорилирование путей FAK, Akt и mTOR, но также индуцирует экспрессию лиганда Fas и расщепление прокаспазы-8 и 9, что приводит к более сильной индукции апоптоза по сравнению с аррестеном. Эти наблюдения были ограничены эндотелиальными клетками и клетками аденокарциномы молочной железы человека [25].

Тумстатин является производным α3-цепи, и высокие уровни мРНК у людей были обнаружены в тканях почек, скелетных мышц и легких, но не в ткани сердца [26], где преимущественно обнаруживаются аррестен и канстатин. Тумстатин связывает рецептор интегрина αvβ3, что приводит к регуляции фосфорилирования путей FAK / PI3K / Akt и mTOR [8,20], тем самым опосредуя изменения не только фокальной адгезии, но и внутриклеточной механики. Интересно, что тумстатин способен связывать сайт рецептора αvβ3 независимым от RGD (Arg, Gly, Asp) образом, что является типичным мотивом связывания рецепторов интегрина, необходимым для антиангиогенной активности, но не для ингибирования пролиферации опухолевых клеток. [16].Рецептор αvβ3 способен образовывать поверхностный комплекс с CD47, который при активации приводит к высвобождению сигналов «не ешьте меня» [27], что приводит к снижению фагоцитоза клеток. Предполагается, что этот поверхностный комплекс играет важную роль в отношении фиброгенеза и, в частности, конечных стадий фиброзных расстройств, поскольку при этих типах заболеваний экспрессия CD47 повышается [27,28]. Сниженный клиренс клеток, продуцирующих ЕСМ, может, таким образом, способствовать нарушению регуляции баланса обмена ЕСМ за счет увеличения количества продуцирующих ЕС клеток в матриксе, что в конечном итоге приводит к фиброзу.Тумстатин подавляет пролиферацию и вызывает апоптоз в эндотелиальных клетках через рецептор αvβ3 [8]. Этот путь активации рецептора был связан с вмешательством в синтез белка, вызванным несоответствием внутриклеточных контрольных точек с точки зрения синтеза белка, что привело к активации путей апоптоза [29,30]. Фрагменты тумстатина способны ингибировать кэп-зависимый синтез белка за счет пониженного фосфорилирования белка, связывающего эукариотический фактор инициации 4E, в экспрессирующих αvβ3 клетках дикого типа, выделенных от мышей дикого типа, но не от мышей с нокаутом по интегрину.Однако те же самые фрагменты не ингибируют и не препятствуют синтезу белка в эмбриональных фибробластах [29], указывая на то, что рецептор интегрина αvβ3 важен для передачи сигналов тумстатина, но полная эффективность передачи сигналов зависит от корецептора (ов). Более того, тумстатин связывается с рецептором интегрина α3β1, который, как было показано, при активации модулирует сродство к рецептору αvβ3, который имеет более мощный сигнальный путь, чем рецептор α3β1 [31]. Это может указывать на то, что тумстатин посредством связывания с рецептором интегрина α3β1 саморегулирует эффективность рецептора αvβ3 и, в конечном итоге, влияет на пролиферацию эндотелиальных клеток, антиангиогенез и рост опухоли.

Тетрастатин, отщепленный от α4-цепи, предположительно новый CDAF, как было показано на модели куриного эмбриона, лишен антиангиогенных свойств молекул, происходящих из α1 – α3 цепей [5,32]. Позднее было подтверждено, что тетрастатин является мощным противоопухолевым матрикином за счет ингибирования пролиферативных и инвазивных свойств клеток меланомы, опосредованного передачей сигналов αvβ3 [33]. Интересно, что тумстатин также передает сигнал через этот рецептор, но, кроме того, способен связывать рецептор RGD-независимым образом, что приводит к антиангиогенным свойствам, но не к ингибированию пролиферации [16].Это может указывать на то, что тетрастатин не обладает способностью связываться RGD-независимым образом с рецептором αvβ3, что приводит только к антипролиферативным сигналам. Было бы интересно выяснить, индуцирует ли связывание тетрастатина с рецептором αvβ3 совместную локализацию с рецептором CD47 и тем самым вызывает антифагоцитарную передачу сигналов, как это видно для тумстатина [28]. Разница в передаче сигналов между тумстатином и тетрастатином может указывать на то, что они могут связывать αvβ3, но имеют дополнительные рецепторы передачи сигналов, функционирующие либо посредством совместной локализации, либо за счет последующего связывания.

Тетрастатин, пентастатин и гексастатин высвобождаются из цепей α4, α5 и α6 соответственно. Они имеют общую гомологию последовательностей с пептидными последовательностями аррестена, канстатина и тумстатина [9], что позволяет предположить, что они обладают одинаковыми антиангиогенными и опухолевыми свойствами. Воздействие пентастатина приводит к очень значительному подавлению пролиферации эндотелиальных клеток, в то время как тетрастатин и гексастатин также вызывают значительное подавление пролиферации, хотя и с меньшей эффективностью [9,34].Для всех трех пептидов наблюдался очень мощный антимиграционный эффект на VEGF-стимулированные эпителиальные клетки [9], причем гексастатин был наиболее сильным, что указывает на то, что эти три пептида могут очень хорошо функционировать как CDAF с аналогичными сигнальными свойствами, как аррестен, канстатин и тумстатин. . Рецепторы еще не были отнесены к тетра-, пента- и гексастатину, но на основании их структуры и гомологии последовательности с другими CDAF из коллагена типа IV рецепторы интегрина могут быть возможными кандидатами на связывание и передачу сигналов.

На основании современной литературы, описывающей CDAF из коллагена IV типа, тумстатин является наиболее сложным матрикином с точки зрения передачи сигналов и участия в заболевании. Однако возможно, что аррестен, канстатин, тетрастатин, пентастатин и гексастатин обладают некоторыми схожими свойствами в отношении связывания с рецептором интегрина, на основании их мощных сигнальных способностей в N- и C-концевых доменах. Остается возможность, что дополнительные рецепторные связи интегрина еще не открыты для этих молекул.Тем не менее, эти молекулы, полученные из обильно экспрессируемого коллагена ЕСМ типа IV, могут служить в качестве новых терапевтических средств для подавления роста опухоли, метастазов и ангиогенеза.

Информационная перегрузка способствует распространению фейковых новостей, и социальные сети знают об этом

Вспомните Энди, который беспокоится о заражении COVID-19. Не имея возможности прочитать все статьи, которые он видит, он полагается на советы надежных друзей. Когда кто-то в Facebook пишет, что опасения пандемии преувеличены, Энди сначала отвергает эту идею.Но затем отель, в котором он работает, закрывается, и, поскольку его работа находится под угрозой, Энди начинает задаваться вопросом, насколько серьезна угроза со стороны нового вируса. В конце концов, никто из его знакомых не умер. Коллега публикует статью о «панике» COVID, созданной Big Pharma в сговоре с коррумпированными политиками, что является насмешкой с недоверием Энди к правительству. Его поиск в Интернете быстро приводит его к статьям, в которых утверждается, что COVID-19 не хуже гриппа. Энди присоединяется к онлайн-группе людей, которые были уволены или опасаются увольнения, и вскоре обнаруживает, что спрашивает, как и многие из них: «Какая пандемия?» Когда он узнает, что несколько его новых друзей планируют принять участие в митинге с требованием положить конец блокировкам, он решает присоединиться к ним.Почти никто из участников массового протеста, включая его самого, не носит маски. Когда его сестра спрашивает о митинге, Энди разделяет убеждение, которое теперь стало частью его личности: COVID — это обман.

Этот пример иллюстрирует минное поле когнитивных предубеждений. Мы предпочитаем информацию от людей, которым доверяем, из нашей группы. Мы обращаем внимание и с большей вероятностью поделимся информацией о рисках, а для Энди — о риске потери работы. Мы ищем и запоминаем то, что хорошо согласуется с тем, что мы уже знаем и понимаем.Эти предубеждения — продукт нашего эволюционного прошлого, и в течение десятков тысяч лет они хорошо нам служили. Люди, которые вели себя в соответствии с ними — например, держались подальше от заросшего пруда, где кто-то сказал, что есть гадюка, — имели больше шансов выжить, чем те, кто этого не сделал.

Однако современные технологии пагубно усиливают эти предубеждения. Поисковые системы направляют Энди на сайты, разжигающие его подозрения, а социальные сети связывают его с единомышленниками, подпитывая его страхи.Что еще хуже, боты — автоматические учетные записи в социальных сетях, которые выдают себя за людей — позволяют заблудшим или злонамеренным субъектам воспользоваться его уязвимостями.

Проблема усугубляется распространением онлайн-информации. Просмотр и создание блогов, видео, твитов и других единиц информации, называемых мемами, стало настолько дешевым и простым, что информационный рынок переполнен. Не имея возможности обработать весь этот материал, мы позволяем своим когнитивным предубеждениям решать, на что нам следует обращать внимание.Эти умственные ярлыки оказывают вредное влияние на то, какую информацию мы ищем, понимаем, запоминаем и повторяем.

Необходимость понять эти когнитивные уязвимости и то, как алгоритмы их используют или манипулируют, стала насущной. В Университете Уорика в Англии и в Обсерватории Блумингтона по социальным сетям при Университете Индианы (OSoMe, произносится как «потрясающе») наши команды используют когнитивные эксперименты, симуляции, интеллектуальный анализ данных и искусственный интеллект, чтобы понять когнитивные уязвимости пользователей социальных сетей.Выводы психологических исследований эволюции информации, проведенных в Уорике, используются для компьютерных моделей, разработанных в Индиане, и наоборот. Мы также разрабатываем аналитические средства и средства машинного обучения для борьбы с манипуляциями в социальных сетях. Некоторые из этих инструментов уже используются журналистами, организациями гражданского общества и отдельными лицами для выявления неаутентичных субъектов, картирования распространения ложных нарративов и повышения новостной грамотности.

Информационная перегрузка

Избыток информации вызвал острую конкуренцию за внимание людей.Как отмечал лауреат Нобелевской премии экономист и психолог Герберт А. Саймон: «То, что потребляет информация, довольно очевидно: она поглощает внимание ее получателей». Одно из первых последствий так называемой экономии внимания — потеря качественной информации. Команда OSoMe продемонстрировала этот результат с помощью набора простых симуляций. Он представлял пользователей социальных сетей, таких как Энди, называемых агентами, как узлы в сети онлайн-знакомств. На каждом временном шаге в симуляции агент может либо создать мем, либо опубликовать еще один мем, который он видит в ленте новостей.Чтобы имитировать ограниченное внимание, агентам разрешено просматривать только определенное количество элементов в верхней части их лент новостей.

Проведя это моделирование на многих временных этапах, Лилиан Венг из OSoMe обнаружила, что по мере того, как внимание агентов становилось все более ограниченным, распространение мемов стало отражать степенное распределение реальных социальных сетей: вероятность того, что мем будет использоваться совместно количество раз было примерно обратной степенью этого числа. Например, вероятность того, что мем поделится три раза, была примерно в девять раз меньше, чем вероятность того, что мем поделится один раз.

Эта модель популярности мемов, в которой победитель получает все, большинство из которых почти не замечается, а некоторые широко распространены, не может быть объяснена тем, что некоторые из них являются более запоминающимися или более ценными: мемы в этом смоделированном мире не имел внутреннего качества. Виральность возникла исключительно из-за статистических последствий распространения информации в социальной сети агентов с ограниченным вниманием.Даже когда агенты предпочтительно делились мемами более высокого качества, исследователь Сяоянь Цю из OSoMe заметил небольшое улучшение общего качества мемов, которыми делились чаще всего. Наши модели показали, что даже когда мы хотим видеть и делиться высококачественной информацией, наша неспособность просматривать все в наших новостных лентах неизбежно приводит к тому, что мы делимся тем, что частично или полностью не соответствует действительности.

Когнитивные искажения сильно усугубляют проблему. В серии новаторских исследований в 1932 году психолог Фредерик Бартлетт рассказал добровольцам легенду коренных американцев о молодом человеке, который слышит боевые кличи и, преследуя их, вступает в сказочную битву, которая в конечном итоге приводит к его настоящей смерти.Бартлетт попросил добровольцев, которые не были коренными жителями, вспоминать довольно запутанную историю через увеличивающиеся промежутки времени, от минут до лет спустя. Он обнаружил, что с течением времени воспоминания склонны искажать культурно незнакомые части рассказа так, что они либо теряются для памяти, либо превращаются в более знакомые вещи. Теперь мы знаем, что наш разум делает это все время: он корректирует наше понимание новой информации так, чтобы оно соответствовало тому, что мы уже знаем. Одним из следствий этой так называемой предвзятости подтверждения является то, что люди часто ищут, вспоминают и понимают информацию, которая лучше всего подтверждает то, во что они уже верят.

Исправить эту тенденцию крайне сложно. Эксперименты неизменно показывают, что даже когда люди сталкиваются с сбалансированной информацией, содержащей взгляды с разных точек зрения, они, как правило, находят подтверждающие доказательства того, во что они уже верят. И когда людям с разными взглядами на эмоциональные проблемы, такие как изменение климата, показывают одну и ту же информацию по этим темам, они становятся еще более приверженными своей исходной позиции.

Что еще хуже, поисковые системы и платформы социальных сетей предоставляют персонализированные рекомендации, основанные на огромных объемах имеющихся данных о прошлых предпочтениях пользователей.Они уделяют приоритетное внимание информации в наших лентах, с которой мы, скорее всего, согласны, независимо от того, насколько они незначительны, и ограждают нас от информации, которая может изменить наше мнение. Это делает нас легкой мишенью для поляризации. Нир Гринберг и его коллеги из Северо-Восточного университета недавно показали, что консерваторы в США более восприимчивы к дезинформации. Но наш собственный анализ потребления некачественной информации в Twitter показывает, что уязвимость распространяется на обе стороны политического спектра, и никто не может полностью избежать ее.Даже наша способность обнаруживать онлайн-манипуляции зависит от нашей политической предвзятости, хотя и не симметрично: пользователи-республиканцы с большей вероятностью принимают ботов, продвигающих консервативные идеи, за людей, тогда как демократы с большей вероятностью принимают консервативных пользователей-людей за ботов.

Social Herding

В августе 2019 года в Нью-Йорке люди начали убегать от того, что звучало как выстрелы. Другие последовали за ним, некоторые кричали: «Стрелок!» Только позже они узнали, что взрыв произошел из-за мотоцикла.В такой ситуации может быть полезно сначала запустить, а потом задавать вопросы. В отсутствие четких сигналов наш мозг использует информацию о толпе, чтобы сделать вывод о соответствующих действиях, подобно поведению стайной рыбы и стаи птиц.

Такое социальное соответствие широко распространено. В увлекательном исследовании 2006 года с участием 14 000 веб-волонтеров Мэтью Салганик, работавший тогда в Колумбийском университете, и его коллеги обнаружили, что, когда люди видят, какую музыку скачивают другие, они в конечном итоге скачивают похожие песни.Более того, когда люди были изолированы в «социальные» группы, в которых они могли видеть предпочтения других в своем кругу, но не имели информации о посторонних, выбор отдельных групп быстро расходился. Но предпочтения «несоциальных» групп, где никто не знал о выборе других, оставались относительно стабильными. Другими словами, социальные группы создают настолько сильное давление в сторону соответствия, что оно может преодолеть индивидуальные предпочтения, и, усиливая случайные ранние различия, оно может привести к тому, что сегрегированные группы разойдутся до крайностей.

Социальные сети следуют аналогичной динамике. Мы путаем популярность с качеством и в конечном итоге копируем наблюдаемое поведение. Эксперименты в Twitter, проведенные Бьярке Мёнстедом и его коллегами из Технического университета Дании и Университета Южной Калифорнии, показывают, что информация передается посредством «комплексного заражения»: когда мы постоянно сталкиваемся с идеей, обычно из многих источников, мы с большей вероятностью принять и опубликовать его у себя. Эта социальная предвзятость еще больше усиливается тем, что психологи называют эффектом «простого воздействия»: когда люди неоднократно подвергаются воздействию одних и тех же раздражителей, таких как определенные лица, они начинают нравиться эти раздражители больше, чем те, с которыми они сталкивались реже.

Такие предубеждения выливаются в непреодолимое желание обращать внимание на информацию, которая становится вирусной — если все говорят об этом, она должна быть важной. Платформы социальных сетей, такие как Facebook, Twitter, YouTube и Instagram, не только демонстрируют нам элементы, которые соответствуют нашим взглядам, но и размещают популярный контент в верхней части экрана и показывают, сколько людей что-то понравилось и чем поделились.Мало кто из нас понимает, что эти подсказки не обеспечивают независимую оценку качества.

Фактически, программисты, разрабатывающие алгоритмы ранжирования мемов в социальных сетях, предполагают, что «мудрость толпы» быстро определит высококачественные элементы; они используют популярность как показатель качества. Наш анализ огромного количества анонимных данных о кликах показывает, что все платформы — социальные сети, поисковые системы и новостные сайты — преимущественно обслуживают информацию из узкого подмножества популярных источников.

Чтобы понять почему, мы смоделировали, как они сочетают в своем рейтинге сигналы качества и популярности. В этой модели агенты с ограниченным вниманием — те, кто видит только определенное количество элементов в верхней части своих новостных лент — также с большей вероятностью будут нажимать на мемы, получившие более высокий рейтинг на платформе. Каждый предмет обладает внутренним качеством, а также уровнем популярности, определяемым количеством нажатий на него. Другая переменная отслеживает степень, в которой рейтинг зависит от популярности, а не от качества.Моделирование этой модели показывает, что такая алгоритмическая предвзятость обычно снижает качество мемов даже при отсутствии предвзятости со стороны человека. Даже когда мы хотим поделиться лучшей информацией, алгоритмы в конечном итоге вводят нас в заблуждение.

Эхо-камеры

Большинство из нас не верят, что мы следуем за стадом. Но наша предвзятость к подтверждению заставляет нас следовать за другими, похожими на нас, динамика, которую иногда называют гомофилией — тенденция единомышленников соединяться друг с другом. Социальные сети усиливают гомофилию, позволяя пользователям изменять структуру своих социальных сетей, подписываясь на них, удаляя их из друзей и т. Д.В результате люди разделяются на большие, плотные и все более дезинформированные сообщества, обычно описываемые как эхо-камеры.

В OSoMe мы исследовали появление онлайн-эхо-камер с помощью другого моделирования, EchoDemo. В этой модели у каждого агента есть политическое мнение, представленное числом от -1 (скажем, либеральное) до +1 (консервативное). Эти наклонности отражены в сообщениях агентов. На агентов также влияют мнения, которые они видят в своих новостных лентах, и они могут отписаться от пользователей с разными мнениями.Начав со случайных начальных сетей и мнений, мы обнаружили, что сочетание социального влияния и отказа от подписки значительно ускоряет формирование поляризованных и сегрегированных сообществ.

Действительно, политические эхо-камеры в Твиттере настолько сильны, что политические пристрастия отдельных пользователей можно предсказать с высокой точностью: вы придерживаетесь того же мнения, что и большинство ваших знакомых. Эта камерная структура эффективно распространяет информацию внутри сообщества, изолируя это сообщество от других групп.В 2014 году наша исследовательская группа стала мишенью кампании по дезинформации, в которой утверждалось, что мы участвовали в политически мотивированных усилиях по подавлению свободы слова. Это ложное обвинение вирусным образом распространилось в основном в консервативной эхо-камере, в то время как разоблачающие статьи проверяющих факты находили в основном в либеральном сообществе. К сожалению, такое отделение фейковых новостей от отчетов о проверке фактов является нормой.

Социальные сети также могут увеличить наш негатив. В недавнем лабораторном исследовании Роберт Ягайло, также из Уорика, обнаружил, что социальная информация не только укрепляет наши предубеждения, но и становится более устойчивой к исправлению.Он исследовал, как информация передается от человека к человеку в так называемой социальной цепи распространения. В ходе эксперимента первый человек в цепочке прочитал серию статей о ядерной энергетике или пищевых добавках. Статьи были разработаны таким образом, чтобы быть сбалансированными и содержать как много положительной информации (например, о меньшем загрязнении углеродом или о продуктах длительного хранения), так и отрицательной (например, о риске расплавления или возможном вреде для здоровья).

Первый человек в цепочке социального распространения рассказал следующему человеку о статьях, второй рассказал третьему и так далее.Мы наблюдали общее увеличение количества негативной информации по мере ее прохождения по цепочке, известное как социальное усиление риска. Более того, работа Даниэль Дж. Наварро и ее коллег из Университета Нового Южного Уэльса в Австралии показала, что информация в цепочках социального распространения наиболее восприимчива к искажениям со стороны людей с самыми крайними предубеждениями.

Хуже того, социальное распространение также делает негативную информацию более «липкой». Когда Ягайло впоследствии представил людям в цепях социальной диффузии исходную сбалансированную информацию — то есть новости, которые видел первый человек в цепочке, — сбалансированная информация мало что сделала для уменьшения негативного отношения людей.Информация, которая прошла через людей, стала не только более негативной, но и более устойчивой к обновлению.

Исследование 2015 года, проведенное исследователями OSoMe Эмилио Феррара и Зеяо Янгом, проанализировало эмпирические данные о таком «эмоциональном заражении» в Твиттере и обнаружило, что люди, чрезмерно подверженные негативному содержанию, обычно затем делятся негативными сообщениями, тогда как те, кто чрезмерно подвержен позитивному контенту, как правило, делятся более позитивными сообщениями . Поскольку отрицательный контент распространяется быстрее, чем положительный, эмоциями легко манипулировать, создавая повествования, вызывающие отрицательные реакции, такие как страх и беспокойство.Феррара, который сейчас работает в Университете Южной Калифорнии, и его коллеги из Фонда Бруно Кесслера в Италии показали, что во время референдума Испании 2017 года о независимости Каталонии социальные боты использовались для ретвита жестоких и подстрекательских рассказов, что увеличивало их разоблачение и обостряло социальный конфликт.

Восстание ботов

Качество информации еще больше ухудшается из-за социальных ботов, которые могут использовать все наши когнитивные лазейки. Ботов создавать легко. Платформы социальных сетей предоставляют так называемые интерфейсы прикладного программирования, благодаря которым для одного субъекта довольно легко настроить тысячи ботов и управлять ими.Но усиление сообщения, даже с помощью всего лишь нескольких ранних голосов ботов на платформах социальных сетей, таких как Reddit, может иметь огромное влияние на последующую популярность сообщения.

В OSoMe мы разработали алгоритмы машинного обучения для обнаружения социальных ботов. Один из них, Botometer, представляет собой общедоступный инструмент, который извлекает 1200 функций из данной учетной записи Twitter, чтобы охарактеризовать ее профиль, друзей, структуру социальной сети, временные шаблоны активности, язык и другие особенности. Программа сравнивает эти характеристики с характеристиками десятков тысяч ранее идентифицированных ботов, чтобы дать учетной записи Twitter оценку вероятного использования автоматизации.

По нашим оценкам, в 2017 году до 15 процентов активных учетных записей Twitter были ботами и что они сыграли ключевую роль в распространении дезинформации в период выборов 2016 года в США. В течение нескольких секунд после публикации фальшивой новостной статьи — например, статьи, утверждающей, что кампания Клинтона была причастна к оккультным ритуалам, — ее писали в Твиттере многие боты, а люди, обманутые очевидной популярностью контента, ретвитнули ее.

Боты также влияют на нас, делая вид, что представляют людей из нашей группы.Бот должен только подписаться на кого-то в онлайн-сообществе, поставить лайк и ретвитнуть его, чтобы быстро проникнуть в него. Исследователь OSoMe Сяодан Лу разработал другую модель, в которой некоторые из агентов являются ботами, которые проникают в социальную сеть и делятся обманчиво привлекательным некачественным контентом — подумайте о кликбейте. Один параметр в модели описывает вероятность того, что подлинный агент будет следовать за ботами, которые для целей этой модели мы определяем как агентов, которые генерируют мемы нулевого качества и ретвитят только друг друга.Наше моделирование показывает, что эти боты могут эффективно подавлять качество информации всей экосистемы, проникая только в небольшую часть сети. Боты также могут ускорить формирование эхо-камер, предлагая следовать другим недостоверным учетным записям, метод, известный как создание «следящих поездов».

Некоторые манипуляторы играют на обеих сторонах пропасти через отдельные сайты фейковых новостей и ботов, вызывая политическую поляризацию или монетизацию с помощью рекламы. В OSoMe мы недавно обнаружили сеть неаутентичных учетных записей в Твиттере, которые все координировались одним и тем же лицом.Некоторые выдавали себя за сторонников Трампа в кампании «Сделаем Америку снова великой», в то время как другие выдавали себя за «сопротивляющихся» Трампа; все просили политических пожертвований. Такие операции усиливают контент, основанный на предвзятости подтверждения, и ускоряют формирование поляризованных эхо-камер.

Ограничение онлайн-манипуляций

Понимание наших когнитивных предубеждений и того, как их используют алгоритмы и боты, позволяет нам лучше защищаться от манипуляций. OSoMe разработала ряд инструментов, чтобы помочь людям понять свои собственные уязвимости, а также слабые места платформ социальных сетей.Одно из них — мобильное приложение под названием Fakey, которое помогает пользователям научиться распознавать дезинформацию. Игра имитирует новостную ленту социальных сетей, показывая актуальные статьи из источников с низким и высоким уровнем доверия. Пользователи должны решить, чем они могут или не должны делиться и что проверять. Анализ данных Fakey подтверждает преобладание онлайн-социального скотоводства: пользователи с большей вероятностью будут делиться статьями с низким уровнем достоверности, если считают, что ими поделились многие другие люди.

Другая общедоступная программа под названием Hoaxy показывает, как любой существующий мем распространяется через Twitter.В этой визуализации узлы представляют собой фактические учетные записи Twitter, а ссылки показывают, как ретвиты, цитаты, упоминания и ответы распространяют мем от учетной записи к учетной записи. Каждый узел имеет цвет, соответствующий его оценке от Botometer, что позволяет пользователям видеть шкалу, в которой боты усиливают дезинформацию. Эти инструменты использовались журналистами-расследователями, чтобы раскрыть корни кампаний дезинформации, таких как та, которая продвигает заговор «pizzagate» в США.Они также помогли выявить попытки подавления избирателей с помощью ботов во время U.С. Промежуточные выборы. Однако манипулирование становится все труднее обнаружить, поскольку алгоритмы машинного обучения лучше имитируют поведение человека.

Помимо распространения фейковых новостей, кампании дезинформации могут также отвлечь внимание от других, более серьезных проблем. Для борьбы с подобными манипуляциями мы недавно разработали программный инструмент под названием BotSlayer. Он извлекает хэштеги, ссылки, учетные записи и другие функции, которые встречаются в твитах по темам, которые пользователь хочет изучать. Для каждой сущности BotSlayer отслеживает твиты, публикующие их учетные записи и оценки их ботов, чтобы пометить сущности, которые имеют тенденцию и, вероятно, усиливаются ботами или скоординированными учетными записями.Цель состоит в том, чтобы позволить журналистам, организациям гражданского общества и политическим кандидатам выявлять и отслеживать недостоверные кампании влияния в режиме реального времени.

Эти программные инструменты являются важными помощниками, но также необходимы институциональные изменения для сдерживания распространения фейковых новостей. Образование может помочь, хотя вряд ли оно охватит все темы, по которым людей вводят в заблуждение. Некоторые правительства и платформы социальных сетей также пытаются пресечь онлайн-манипуляции и фальшивые новости.Но кто решает, что фальшивка или манипуляция, а что нет? Информация может иметь предупреждающие надписи, подобные тем, которые начали предоставлять Facebook и Twitter, но можно ли доверять людям, которые наносят эти ярлыки? Риск того, что такие меры могут преднамеренно или непреднамеренно подавить свободу слова, которая имеет жизненно важное значение для крепких демократий, является реальным. Доминирование платформ социальных сетей с глобальным охватом и тесными связями с правительствами еще больше усложняет возможности.

Одна из лучших идей — усложнить создание и обмен некачественной информацией.Это может включать добавление трений, заставляя людей платить за обмен или получение информации. Оплата может быть в форме времени, умственной работы, такой как головоломки, или микроскопических сборов за подписку или использование. К автоматическим публикациям следует относиться как к рекламе. Некоторые платформы уже используют трение в виде CAPTCHA и телефонного подтверждения для доступа к аккаунтам. Twitter наложил ограничения на автоматическую публикацию сообщений. Эти усилия можно было бы расширить, чтобы постепенно сместить стимулы к обмену в Интернете в пользу информации, представляющей ценность для потребителей.

Бесплатное общение не бесплатное. Уменьшая стоимость информации, мы снизили ее ценность и предложили подделку. Чтобы восстановить работоспособность нашей информационной экосистемы, мы должны понимать уязвимость нашего перегруженного ума и то, как можно использовать экономику информации, чтобы защитить нас от заблуждения.

Границы | Доксициклин подавляет свойства раковых стволовых клеток через путь PAR1 / FAK / PI3K / AKT при раке поджелудочной железы

Введение

Рак поджелудочной железы является желудочно-кишечным заболеванием с высокой смертностью и обычно диагностируется на поздней стадии (1, 2).Прогноз рака поджелудочной железы плохой, а его 5-летняя выживаемость составляет всего 9% (3). Небольшая популяция раковых стволовых клеток (РСК) в опухоли обладает способностью самообновляться и поддерживать опухоль (4). В 2007 году Ли и др. были первыми, кто изолировал и идентифицировал РСК поджелудочной железы (5). Многие пути, такие как сигнальный путь hedgehog (Hh), были активированы в РСК поджелудочной железы (6, 7). Эпителиально-мезенхимальная трансформация (EMT) может приводить к CSC-подобному фенотипу (8). Активация EMT может генерировать CSC и влиять на дифференцировку и метастазирование раковых клеток (9).

Активированный протеазой рецептор 1 (PAR1), также известный как рецептор тромбина (10), представляет собой рецептор, связанный с G-белком. МРНК PAR1 имеет более высокий уровень экспрессии в клетках рака поджелудочной железы, чем в ткани поджелудочной железы (11). PAR1 может опосредовать ремоделирование микросреды опухоли, способствуя способности к пролиферации, способности к ангиогенезу и злокачественному развитию многих видов опухолей (12–14). Однако о влиянии PAR1 на CSC-подобные свойства клеток рака поджелудочной железы не сообщалось.

Киназа фокальной адгезии (FAK) — это цитоплазматическая протеинтирозинкиназа, которая регулирует движение цитоскелета и необходима для движения клеток (15).FAK сверхэкспрессируется в раковых клетках (16) и может активироваться фосфорилированием, чтобы участвовать в трансдукции множественных сигнальных путей и самообновлении CSC (17, 18). PAR1 может регулировать самофосфорилирование FAK в клетках пигментного эпителия сетчатки (19). О влиянии PAR1 на путь FAK при раке поджелудочной железы не сообщалось.

Доксициклин — третье поколение полусинтетических тетрациклиновых антибиотиков широкого спектра действия (20). Он работает, подавляя синтез бактериального белка (21).Доксициклин обладает противоопухолевым действием (22-25). Однако его молекулярный механизм полностью не выяснен. В этой работе оценивалось влияние доксициклина на CSC-подобные свойства рака поджелудочной железы.

Оценивали влияние PAR1 на формирование CSC-подобных свойств при раке поджелудочной железы и влияние доксициклина на рак поджелудочной железы. PAR1 может способствовать CSC-подобным свойствам и EMT клеток рака поджелудочной железы через путь FAK / PI3K / AKT. Доксициклин подавляет CSC-подобные свойства поджелудочной железы, воздействуя на PAR1 и усиливая терапевтический эффект 5-фторурацила (5-FU).

Материалы и методы

Культура клеток

Клеточные линии рака поджелудочной железы человека Panc-1 и Aspc-1 были приобретены у KeyGEN BioTECH и содержались в средах, рекомендованных поставщиками. Клеточные линии рака поджелудочной железы человека Panc-1 и Aspc-1 поддерживали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Клетки культивировали при 37 ° C с 5% CO ₂ в увлажненной атмосфере.

Генная трансфекция

PAR1-pCDNA3.1 плазмиду и миРНК использовали для экспериментов по трансфекции. Для трансфекции 2,5 мкг ДНК и 75 пмоль миРНК добавляли к 100 мкл среды Opti-MEM и смешивали со 100 мкл Opti-MEM, содержащей 10 мкл липофектамина 2000, в течение 20 мин при комнатной температуре. Перед трансфекцией клетки высевали в шестилуночный планшет и трансфицировали указанным выше комплексом в течение 48 часов.

Вестерн-блот-анализ

Клетки промывали холодным PBS, лизировали в буфере для лизиса в течение 30 минут и центрифугировали в течение 10 минут при 4 ° C.Концентрацию белка измеряли с помощью набора для анализа белка BCA (бицинхониновая кислота). Образцы белков разделяли с помощью электрофореза в 10% SDS-полиакриламидном геле и переносили электропереносом на мембраны из поливинилдиендифторида (PVDF). После блокирования клеток BSA мембраны PVDF инкубировали в течение ночи при 4 ° C с первичными антителами, включая PAR1 (аффинность, 1: 1000), FAK (аффинность, 1: 1000), p-FAK (аффинность, 1: 1000). , виментин (VIM, Affinity, 1: 1000), E-кадгерин (E-Cad, Affinity, 1: 500), PI3K (Affinity, 1: 500), p-PI3K (Affinity, 1: 500), AKT (Affinity , 1: 500), p-AKT (Affinity, 1: 500) и GAPDH (Affinity, 1: 4000), а также с вторичными HRP-конъюгированными козьими антикроличьими антителами (Invitrogen, 1: 5000).Белки визуализировали по усиленной хемилюминесценции и анализировали с помощью программного обеспечения Image J.

Проточная цитометрия

Клетки Panc-1 и Aspc-1 высевали в шестилуночный планшет и обрабатывали доксициклином, плазмидой PAR1-pCDNA3.1 или PAR1-миРНК в течение 72 часов. Для проточной цитометрии клетки Panc-1 и Aspc-1 переваривали и дважды промывали PBS. После фиксации клеток 70% холодным метанолом и блокировки 5% BSA их инкубировали с первичными антителами CD133 (аффинность, 1: 200). Клетки инкубировали с зелеными флуоресцентными вторичными антителами.Зеленую флуоресценцию анализировали с помощью проточного цитометра FACScan, а результат анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo.

Обнаружение жизнеспособности клеток

Жизнеспособность клеток рака поджелудочной железы оценивали с помощью анализа МТТ. Клетки (1 × 10 ⁴ ) высевали в 96-луночные планшеты в течение ночи. Экспериментальные группы получали доксициклин и комбинированные препараты с разными концентрациями, а группу отрицательного контроля лечили растворителем в течение 48, 72 и 96 часов. Затем в клетки добавляли МТТ и инкубировали 4 ч.Синтезированные кристаллы формазана растворяли, используя 100 мкл ДМСО, и оптическую плотность измеряли при 570 нм. IC50 доксициклина рассчитывали с использованием GraphPad Prism 7.0.

Анализ инвазии

Планшет трансвеллеров использовался для анализа инвазии. Клетки Panc-1 и Aspc-1 суспендировали и помещали в верхнюю часть камер трансвелл, покрытых матригелем, а нижнюю камеру заполняли средой, содержащей 10% FBS. Клетки культивировали при 37 ° C в течение 48 ч. Мембраны фиксировали 4% параформальдегидом и окрашивали 0.1% кристаллический фиолетовый. Затем клетки на верхней части мембран осторожно удаляли. Клетки, которые проникли через мембрану, подсчитывали под микроскопом и сравнивали с различными концентрациями лекарства.

Анализ заживления ран

Клетки Panc-1 и Aspc-1 высевали в 24-луночный планшет и выращивали до слияния от 70% до 80%. На каждой лунке была нацарапана рана. Клетки обрабатывали доксициклином различных концентраций, разведенным в среде без FBS. Расстояние до раны фотографировали через 0, 24 и 48 ч под световым микроскопом (Nikon).Для каждой группы было установлено по три параллельные лунки.

Иммунофлуоресценция

Клетки Panc-1 и Aspc-1 высевали в 24-луночный планшет, обрабатывали 30 и 60 мкМ доксициклина и культивировали в течение 72 часов. Клетки промывали PBS, фиксировали 4% параформальдегидом в течение 20 минут и пермеабилизировали 0,1% Triton X-100 в течение 15 минут. После блокирования клеток 5% BSA в течение 30 минут их иммуноблотировали в течение ночи с первичными антителами, включая E-Cad и VIM (1: 200) и флуоресцентными вторичными антителами (1: 200).E-Cad был помечен зеленой флуоресценцией, а VIM — красной флуоресценцией. Наконец, ядро ​​окрашивали DAPI. Клетки фотографировали под лазерным сканирующим конфокальным микроскопом (LSCM, Nikon). Все эксперименты проводили в трех повторностях.

Эксперимент по формированию клонирования

Клетки Panc-1 и Aspc-1 высевали в шестилуночный планшет с плотностью приблизительно 300 клеток на лунку. Через 24 часа клетки обрабатывали доксициклином, плазмидой PAR1-pCDNA3.1 или миРНК и культивировали в течение 14 дней.Колонии фиксировали 4% параформальдегидом и окрашивали 0,1% кристаллическим фиолетовым. Подсчитывали количество колоний и сравнивали в разных группах.

Внутриклеточный Ca

Готовили одноклеточную суспензию клеток рака поджелудочной железы, и 1,2 × 10 ⁴ клеток на лунку высевали в планшет 384. После присоединения клеток среду аспирировали и в каждую лунку добавляли 25 мкл DMEM, содержащей различные концентрации доксициклина, и 25 мкл Calcium Assay kit Loading, чтобы убедиться, что конечные концентрации доксициклина составляли 0, 5, 10, 30, 60. , и 100 мкМ.Раствор тромбина Advance разбавляли до 2 Ед / мл средой DMEM. В экспериментальные группы добавляли 12,5 мкл раствора тромбина, а в контрольную группу добавляли 12,5 мкл среды DMEM. Автоматический многофункциональный считыватель микропланшетов использовался для обнаружения сигнала потока кальция.

Исследования на животных

Самцов голых мышей BALB / C (возраст 5-6 недель) содержали в учреждениях по уходу за животными без специфических патогенов. Все исследования на животных проводились в соответствии с Руководством по использованию животных Национального института здравоохранения и действующими китайскими правилами и стандартами использования лабораторных животных.Все процедуры с животными были одобрены в соответствии с руководящими принципами комитета по этике животных Тяньцзиньской международной объединенной академии биотехнологии и медицины. Ксенотрансплантаты опухолей Panc-1 (1 × 10 ⁶ / мл), суспендированные в PBS, получали подкожной инъекцией в бок. Когда объем опухоли достигал приблизительно 50 мм. ³ , экспериментальным мышам вводили доксициклин и 5-FU через желудочный зонд, тогда как модельным и контрольным мышам давали дистиллированную воду. Объем опухолей мышей nude контролировали каждые 2 дня и рассчитывали с использованием следующего уравнения: объем опухоли = ab ² /2 (а — длина опухоли; b — ширина опухоли).После 60 дней лечения все мыши были умерщвлены. Опухоли, печень и легкие собирали и фиксировали 10% формалином.

Иммуногистохимический анализ

Срезы опухолей от узловых мышей использовали для иммунохимического исследования экспрессии E-Cad, VIM и CD133. Предметные стекла депарафинизировали и повторно гидратировали, а антиген извлекали с помощью 0,01 М цитратного буфера. Предметные стекла помещали во влажный бокс после блокирования сывороткой в ​​течение 30 мин и инкубировали в течение ночи с первичными антителами, включая CD133 (1: 100), VIM (1: 100) и E-Cad (1: 100).Первичные антитела смывали и добавляли сенсибилизатор на 20 мин. Биотинилированное вторичное антитело козы против кролика добавляли на 30 мин. Наконец, слайды окрашивали DAB и гематоксилином, наблюдали под микроскопом и фотографировали. Интенсивность окрашивания оценивали следующим образом: отсутствие (0), слабый коричневый (1+), умеренно коричневый (2+) и сильный коричневый (3+). Процент положительных клеток был разделен на пять классов на основе процента окрашенных опухолевых клеток, а именно: 0 — отсутствие клеток, 1 — от 1 до 25%, 2% — от 25 до 50%, 3 — 50%. до 75% и 4 для> 75%.

Анализ предельного разбавления

Клетки Panc-1 разводили до следующих плотностей: 2 × 10 ⁷ / мл, 2 × 10 ⁶ / мл и 2 × 10 ⁵ / м. Суспензию вводили в правую спину голых мышей по 100 мкл на инъекцию. Наблюдали за статусом роста опухолей и рассчитывали скорость туморогенеза в каждой группе через 2 месяца.

Анализ данных TCGA

Репрезентативные изображения иммуногистохимического анализа были получены из Атласа белков человека (https: // www.proteinatlas.org). Образцы TCGA для транскрипционного анализа были получены из базы данных UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/index.html). Информация об экспрессии PAR1 и FAK в образцах рака поджелудочной железы TCGA была загружена из Human Protein Atlas для корреляционного анализа. Дифференциальный анализ PAR1 в образцах рака поджелудочной железы TCGA проводили в DECenter (Sanger Box). Затем значительно активированные гены (| logFC | ≥1.0) были проанализированы с помощью обогащения GO и KEGG через веб-сайт Metascape (http: // metascape.org /). А белки, на которые влияет PAR1, были проанализированы с помощью анализа PPI (https://string-db.org/).

Статистика

Каждый эксперимент повторяли трижды. Данные были представлены как среднее ± стандартное отклонение и проанализированы с помощью призмы GraphPad 7. Множественные сравнения были выполнены с помощью двухфакторного дисперсионного анализа. Разница в P <0,05 считалась статистически значимой.

Результаты

PAR1 способствует CSC-подобным свойствам клеток рака поджелудочной железы

Экспрессия PAR1 в клеточных линиях рака поджелудочной железы была обнаружена с помощью вестерн-блоттинга.Уровень экспрессии PAR1 был самым высоким в клеточной линии Panc-1, но самым низким в клеточной линии Aspc-1 (рис. 1A). Таким образом, клетки Panc-1 были отобраны для нокдауна PAR1 с использованием siRNA, а клетки Aspc-1 были использованы для сверхэкспрессии PAR1 с использованием плазмиды PAR1-pCDNA3.1 в следующем эксперименте. Обнаружено влияние PAR1 на экспрессию маркеров CSC поджелудочной железы и способность формировать плавающую маммосферу. Уровень экспрессии CD133 и способность образовывать маммосферу были снижены в интерференционных PAR1 клетках Panc-1.Сверхэкспрессия PAR1 увеличивает уровень экспрессии CD133 и усиливает способность образовывать маммосферу в клетках Aspc-1 (Фигуры 1B, C). Эксперимент по образованию колоний показал, что сверхэкспрессия PAR1 способствовала образованию колоний клеток Aspc-1, а нокдаун PAR1 ингибировал образование колоний клеток Panc-1 (рис. 1D). Анализ предельного разведения (с использованием клеток Panc-1 и PAR1, подавляющих клетки Panc-1) показал, что частота CSC поджелудочной железы была значительно снижена в группе sh-PAR1 по сравнению с контрольной группой (рис. 1E).

Рис. 1 PAR1 способствует подобным раковым стволовым клеткам свойствам клеток рака поджелудочной железы. (A) Уровни экспрессии PAR1 в клеточных линиях Panc-1, Bxpc-3 и Aspc-1 определяли с помощью вестерн-блоттинга. (B) Влияние PAR1 на маркеры CD133 стволовых клеток рака поджелудочной железы в клетках Panc-1 и Aspc-1. (C) Влияние PAR1 на способность раковых клеток поджелудочной железы формировать маммосферу в экспериментах по сверхэкспрессии и интерференции PAR1. (D) Влияние PAR1 на образование клонов клеток Panc-1 и Aspc-1. (E) Влияние PAR1 на онкогенность клеток Panc-1 и клеток Panc-1, нокдауна PAR1, с использованием анализа с ограничивающим разведением на мышах-узлах ( n = 8). Частота раковых стволовых клеток определялась ELDA (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda). Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (** P <0,01).

PAR1 способствует прогрессированию ЕМТ раковых клеток поджелудочной железы

Особенности рака поджелудочной железы, похожие на стволовые клетки, связаны с процессом ЕМП в клетках.Было проверено влияние PAR1 на миграцию и инвазию клеток рака поджелудочной железы. Сверхэкспрессия PAR1 может способствовать миграции и способности к инвазии клеток Aspc-1 (фиг. 2A, B). Нокдаун PAR1 может ингибировать способность к миграции и инвазии клеток Panc-1. Эксперименты по вестерн-блоттингу и иммунофлуоресценции показали, что избыточная экспрессия PAR1 может способствовать экспрессии мезенхимального маркера виментина (VIM) и ингибировать экспрессию эпителиального маркера E-кадгерина (E-cad) (Фигуры 2C, D) в клетках Aspc-1.Нокдаун PAR1 может ингибировать экспрессию VIM и увеличивать экспрессию E-cad в клетках Panc-1. Эти результаты показали, что PAR1 может способствовать ЭМП клеток рака поджелудочной железы.

Рисунок 2 PAR1 способствует прогрессированию EMT раковых клеток поджелудочной железы. (A) Эффект PAR1 на потенциал миграции клеток Panc-1 и Aspc-1, обнаруженный с помощью анализа заживления ран. (B) Влияние PAR1 на потенциал инвазии клеток рака поджелудочной железы с использованием анализа трансвелл, покрытого матригелем. (C) Эффект PAR1 на экспрессию E-Cad и VIM, обнаруженный с помощью вестерн-блоттинга. (D) Влияние PAR1 на экспрессию E-Cad и VIM, обнаруженное с помощью иммунофлуоресценции. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (* P < 0,05, ** P < 0,01).

PAR1 и FAK приводят к плохому прогнозу пациентов с раком поджелудочной железы

Данные о пациентах с раком поджелудочной железы были получены из базы данных атласа генома рака (TCGA) ((https: // portal.gdc.cancer.gov/) и использовался для оценки эффекта PAR1 и FAK у пациентов с раком поджелудочной железы. Анализ выживаемости показал, что только двойная положительная экспрессия PAR1 и FAK указывает на плохой прогноз среди пациентов с раком поджелудочной железы (рис. 3А). Иммуногистохимический анализ из Атласа белков человека (http://www.proteinatlas.org/) также показал, что экспрессия PAR1 ( n = 176) и FAK ( n = 176) в опухолях была выше, чем у нормальных ткани поджелудочной железы (рис. 3В).Результаты экспрессии РНК также показали, что экспрессия PAR1 и FAK в опухолях была выше, чем в нормальных тканях поджелудочной железы. Корреляцию экспрессии PAR1 и FAK, AKT, VIM анализировали с использованием образцов от пациентов с раком поджелудочной железы из GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn). Уровень экспрессии PAR1 и FAK ( P <0,05, R = 0,29), AKT ( P <0,05, R = 0,36) и VIM ( P <0,05, R = 0,41) имели положительную корреляцию (рис. 3С). Таким образом, PAR1 может регулировать сигнальный путь FAK / PI3K / AKT и приводить к плохому прогнозу пациентов с раком поджелудочной железы.

Рисунок 3 Влияние PAR1 на прогноз рака поджелудочной железы. (A) Влияние PAR1 и FAK на прогноз рака поджелудочной железы. Данные были получены из базы данных TCGA. (B) Уровни экспрессии PAR1 и FAK в нормальных тканях поджелудочной железы и тканях рака поджелудочной железы. Данные были получены из онлайн-базы данных Human Protein Atlas. (C) Корреляционный анализ между экспрессией PAR1 и FAK, AKT и VIM в образцах рака поджелудочной железы TCGA из GEPIA (http: // gepia.Cance-pku.cn/). Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (* P <0,05, ** P <0,01).

PAR1 может регулировать путь FAK / PI3K / AKT

На основании вышеупомянутых результатов PAR1 может регулировать фосфорилирование FAK при раке поджелудочной железы. Было обнаружено влияние PAR1 на фосфорилирование FAK, и результаты показали, что активация PAR1 тромбином может индуцировать увеличение аутофосфорилирования FAK по Y397 в клетках Aspc-1 с избыточной экспрессией PAR1 (фиг. 4A). FAK может модулировать сигнальный путь PI3K / AKT и способствовать образованию EMT и CSC (26).Таким образом, дополнительно было обнаружено влияние PAR1 на фосфорилирование PI3K / AKT. Активация PAR1 тромбином усиливала фосфорилирование PI3K и AKT в клетках Aspc-1 с избыточной экспрессией PAR1. Вмешательство PAR1 может ингибировать фосфорилирование PI3K и AKT в клетках Panc-1 (рис. 4B). И статистические результаты фосфорилирования PI3K / AKT были показаны на Фигуре 4C. После того, как данные о раке поджелудочной железы из TCGA были сгруппированы на основе уровня экспрессии PAR1, были проанализированы дифференциально экспрессируемые гены между группами с высокой и низкой экспрессией.Результаты анализа обогащения Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) и генной онтологии (GO) показали, что PAR1 влияет на взаимодействие ЕСМ-рецептора, путь передачи сигналов кальция, путь передачи сигналов PI3K / AKT и очаговую адгезию в клетках рака поджелудочной железы (рис. 4D). Результат анализа PPI показал, что PAR1 влияет на функцию кальциевых сигнальных путей, миграцию клеток, рецепторы связывания G-белка и соединения клеток (рис. 4E). Далее были проанализированы дифференциальные гены, вовлеченные в миграцию, пролиферацию, ОСК и апоптоз (рис. 4F).Таким образом, PAR1 может влиять на инвазию раковых клеток, метастазирование, пролиферацию и образование CSC через пути FAK / PI3K / AKT при раке поджелудочной железы.

Рисунок 4 PAR1 может активировать сигнальные пути FAK / PI3K / AKT. (A) Активация PAR1 тромбином может индуцировать аутофосфорилирование FAK по Y397 в клетках Panc-1 и Aspc-1. (B) Влияние PAR1 на фосфорилирование PI3K и AKT в клетках Panc-1 и Aspc-1. (C) Статистические результаты экспрессии p-PI3K и p-AKT в клетках Panc-1 и Aspc-1. (D) Ключевые пути, на которые влияет PAR1 в раковых клетках поджелудочной железы. Геномные данные для пациентов с раком поджелудочной железы были сгруппированы по уровню экспрессии PAR1, а дифференциально экспрессируемые гены были проанализированы с помощью GO и KEGG. (E) PPI анализ белков, участвующих в путях, на которые влияет PAR1. (F) Дифференциально экспрессируемые гены пути PI3K / AKT, миграции, раковых стволовых клеток, путей пролиферации, инвазии и апоптоза. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (** P < 0.01).

Доксициклин ингибирует CSC-подобные свойства клеток рака поджелудочной железы

Анализ мобилизации доксициклина Ca ²⁺ в раковых клетках поджелудочной железы показал, что доксициклин (Doxy) ингибирует сигналы мобилизации внутриклеточного кальция, индуцированные тромбином, в зависимости от дозы ( Рисунок 5А). Результаты анализа МТТ показали, что доксициклин подавлял активность раковых клеток поджелудочной железы в зависимости от времени и дозы (рис. 5B). Скорость половинного ингибирования (IC50) доксициклина составила 987.5, 99,64 и 50,02 мкМ после добавления препарата на 48, 72 и 96 ч соответственно. Было изучено влияние доксициклина на экспрессию маркеров CSC поджелудочной железы и формирование атмосферы. Уровни экспрессии CD133 и способность к образованию баллонов ингибировались доксициклином в клетках Panc-1 (Фигуры 5C, D). Было определено влияние доксициклина на миграцию и инвазию в раковые клетки поджелудочной железы. Доксициклин значительно ингибировал миграцию и способность к инвазии клеток рака поджелудочной железы (рисунки 5E, F).Анализ предельного разведения in vivo также показал, что частота CSC поджелудочной железы Panc-1 была значительно снижена в группе, получавшей доксициклин, по сравнению с таковой в контрольной группе (фиг. 5G). Доксициклин значительно подавлял CSC-подобные свойства клеток рака поджелудочной железы.

Рис. 5 Доксициклин подавляет свойства раковых клеток поджелудочной железы, аналогичные свойствам раковых стволовых клеток. (A) Влияние доксициклина на активацию PAR1, стимулированную тромбином в раковых клетках поджелудочной железы, обнаруженную с помощью анализа на мобилизацию Ca ²⁺ . (B) Влияние доксициклина на жизнеспособность клеток рака поджелудочной железы после 48, 72 и 96 часов лечения. (C) Влияние доксициклина на маркер CD133 стволовых клеток рака поджелудочной железы в клетках Panc-1. (D) Влияние доксициклина на образование в маммосфере клеток Panc-1. (E) Влияние доксициклина на способность к миграции клеток рака поджелудочной железы. (F) Влияние доксициклина на способность к инвазии раковых клеток поджелудочной железы. (G) Анализ предельного разведения стволовых клеток рака поджелудочной железы из клеток Panc-1 после обработки доксициклином у узловых мышей ( n = 8).Частота раковых стволовых клеток определялась ELDA. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (* P < 0,05, ** P < 0,01).

Доксициклин ингибирует путь FAK / PI3K / AKT

Результаты вестерн-блоттинга показали, что уровни фосфорилированных FAK, PI3K и AKT в клетках Panc-1 снизились после обработки доксициклином (Фигуры 6A, B). Результаты иммунофлуоресценции показали, что доксициклин увеличивает экспрессию E-Cad в экспрессии клеток Panc-1 и снижает экспрессию VIM (фигура 6C).Таким образом, доксициклин может ингибировать путь FAK / PI3K / AKT и EMT клеток рака поджелудочной железы.

Рисунок 6 Доксициклин ингибирует сигнальные пути FAK / PI3K / AKT. (A) Клетки Panc-1 обрабатывали доксициклином и стимулировали тромбином в течение указанных интервалов времени, и изменения фосфорилирования FAK выявляли с помощью вестерн-блоттинга. (B) Влияние доксициклина на фосфорилирование PI3K и AKT в клетках Panc-1, обнаруженное с помощью Вестерн-блоттинга. (C) Влияние доксициклина на уровни экспрессии E-Cad и VIM в клетках Panc-1. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (** P <0,01).

Доксициклин подавляет рост рака поджелудочной железы и усиливает терапевтический эффект 5-FU

Влияние доксициклина на жизнеспособность клеток Panc-1, обработанных цисплатином, оксалиплатином, 5-FU, сорафенибом и гемцитабином, было обнаружено с помощью анализа MTT. определить сенсибилизацию доксициклина к химиотерапевтическим препаратам.Лечение доксициклином эффективно усиливало действие химиотерапевтических препаратов по сравнению с результатами, полученными при использовании только химиотерапевтических препаратов. Доксициклин имел синергетический эффект с цисплатином, оксалиплатином, 5-ФУ, сорафенибом и гемцитабином (рисунки 7A – E). Комбинация доксициклина с 5-ФУ показала лучший синергетический эффект.

Рисунок 7 Доксициклин подавляет рост рака поджелудочной железы и усиливает терапевтический эффект 5-ФУ. (A – E) Сенсибилизирующий эффект доксициклина к химиотерапевтическим препаратам в клетках Panc-1 после 72-часовой обработки. (F, G) Изменение объема опухоли подкожных ксенотрансплантатов Panc-1 в доксициклине, 5-ФУ и группе комбинированного лечения. (H) Иммуногистохимическое окрашивание на E-cad, VIM и CD133 в опухолевых тканях. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (* P < 0,05, ** P < 0,01). (I) Молекулярный механизм доксициклина подавляет свойства раковых стволовых клеток рака поджелудочной железы.

Подкожные ксенотрансплантаты Panc-1 использовали для обнаружения эффекта доксициклина и 5-FU для проверки лечебного эффекта доксициклина и 5-FU на рак поджелудочной железы in vivo .Рост опухоли был значительно подавлен в группе доксициклина, 5-FU и комбинированной терапии по сравнению с модельной группой. 5-ФУ в сочетании с доксициклином оказывал наилучшее ингибирующее действие, и степень ингибирования опухоли составляла 80,5% (Фигуры 7F, G). Иммуногистохимический анализ также показал, что при обработке доксициклином экспрессия VIM и CD133 снижалась, тогда как экспрессия E-Cad увеличивалась (фигура 7H).

Обсуждение

Рак поджелудочной железы — заболевание с высокой смертностью и увеличивающейся заболеваемостью (27).РСК могут способствовать инвазии рака, метастазированию и толерантности рака к химиотерапии (28). РСК при раке поджелудочной железы были выделены и идентифицированы Li et al. в 2007 г. Уровень экспрессии PAR1 тесно связан со злокачественной эволюцией рака груди (29). После того, как PAR1 активируется тромбином, он может опосредовать биологическое поведение раковых клеток, включая ремоделирование микроокружения опухоли, и может способствовать развитию злокачественных опухолей через молекулу, расположенную ниже по течению, и регулятор цитокинов.О влиянии PAR1 на раковые клетки поджелудочной железы не сообщалось. Влияние PAR1 на CSC-подобные свойства клеток рака поджелудочной железы было определено в настоящей работе. PAR1 может стимулировать экспрессию маркера CD133 CSC поджелудочной железы, способность образовывать микросферы и CSC-подобные характеристики клеток рака поджелудочной железы. PAR1 также может способствовать миграции, инвазии и EMT клеток рака поджелудочной железы. Таким образом, PAR1 может способствовать CSC-подобным свойствам и EMT клеток рака поджелудочной железы.

PAR1 может индуцировать фосфорилирование FAK в пигментных эпителиальных клетках сетчатки после активации тромбином, о чем не сообщалось при раке поджелудочной железы. PI3K — одна из основных сигнальных молекул пути FAK (30). Путь передачи сигналов PI3K / AKT тесно связан с пролиферацией, миграцией и инвазией раковых клеток, и его аномальная активация может привести к злокачественному развитию рака. FAK может индуцировать образование EMT (31) и CSC через сигнальный путь PI3K / AKT.В настоящем исследовании механизм, лежащий в основе эффекта PAR1 на образование CSC поджелудочной железы, был исследован путем сверхэкспрессии и вмешательства в PAR1 в клеточных линиях рака поджелудочной железы. Фосфорилирование FAK, PI3K и AKT ингибировалось после интерференции PAR1. PAR1 может активировать сигнальный путь FAK / PI3K / AKT в клетках рака поджелудочной железы. Он может опосредовать возникновение EMT и CSC-подобных свойств раковых клеток поджелудочной железы.

В наших предыдущих исследованиях мы обнаружили, что доксициклин является ингибитором PAR1.Доксициклин может сочетаться с ключевыми аминокислотными остатками PAR1 Val257, Leu258, His336, His164 и Leu167, которые ингибируют активность PAR1 (25). В настоящей работе мы показали, что доксициклин может нацеливаться на PAR1 и ингибировать активацию сигнального пути FAK / PI3K / AKT в клетках рака поджелудочной железы, EMT и CSC-подобные свойства клеток рака поджелудочной железы. Были оценены синергические эффекты доксициклина с химиотерапевтическими препаратами, такими как цисплатин, оксалиплатин, гемцитабин и 5-ФУ. Доксициклин в сочетании с 5-ФУ показал лучший синергетический эффект.Кроме того, доксициклин и 5-FU могут ингибировать рост подкожных ксенотрансплантатов Panc-1 у мышей nude. Иммуногистохимический анализ показал значительное увеличение экспрессии E-Cad, тогда как уровни экспрессии VIM и CD133 были значительно снижены. Таким образом, доксициклин ингибировал ЕМТ и CSC-подобные свойства рака поджелудочной железы in vivo .

В заключение, эта работа показала, что PAR1 может способствовать CSC-подобным свойствам рака поджелудочной железы путем активации пути FAK / PI3K / AKT.В качестве ингибитора PAR1 доксициклин может ингибировать CSC-подобные свойства клеток рака поджелудочной железы, нацеленных на путь PAR1 / FAK / PI3K / AKT, и может усиливать терапевтический эффект 5-FU (рис. 7I). Эта работа показала, что PAR1 может быть терапевтической мишенью рака поджелудочной железы, и предоставила понимание терапевтических стратегий рака поджелудочной железы.

Заявление о доступности данных

Оригинальные материалы, представленные в исследовании, включены в статьи / дополнительные материалы. Дальнейшие запросы можно направлять соответствующим авторам.

Заявление об этике

Исследование на животных было рассмотрено и одобрено руководящими принципами Комитета по этике животных Тяньцзиньской международной объединенной академии биотехнологии и медицины.

Вклад авторов

TS и HL разработали проекты. Рукопись написали HL, HT и HQW. HL, HT, HQW, YY и RY проводили эксперименты. HL, HT, HQW, XTD, XJD и SC предоставили техническую и материальную поддержку. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

Финансирование

Это исследование финансировалось Национальными фондами естественных наук Китая (гранты 81872374, 81703581, 81972746, 81871972 и 81972629), Тяньцзиньским научно-технологическим проектом (гранты 19JCJQJC63200000, 1860TSYJC). Китайский национальный крупный научный и технологический специальный проект «Разработка значительных новых лекарственных средств» (грант № 2018ZX09736-005) и Национальная программа ключевых исследований и разработок Китая (грант № 2018YFA0507203).

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Сокращения

РСК, раковые стволовые клетки; Докси, Доксициклин; PAR1, рецептор активации протеазы 1; FAK, киназа фокальной адгезии; EMT, эпителиально-мезенхимальная трансформация; 5-ФУ, 5-фторурацил; TCGA, атлас генома рака; KEGG, Киотская энциклопедия генов и геномов; GO, генная онтология; DMEM, среда Игла, модифицированная Дульбекко; FBS, фетальная бычья сыворотка; ВИМ, виментин; E-cad, E-cadherin; IC50, коэффициент половинного ингибирования

Ссылки

4.Дитрих Ф., Мартинс Дж. П., Кайзер С., Силва РБМ, Рокенбах Л., Эдельвейс МВД и др. Очищенная фракция гликозидов хинновой кислоты из Uncaria tomentosa защищает мышей от геморрагического цистита, вызванного циклофосфамидом. PLoS One (2015) 10 (7): e0131882. doi: 10.1371 / journal.pone.0131882

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

5. Ли К., Хейдт Д.Г., Далерба П., Бурант С.Ф., Чжан Л., Адсей В. и др. Идентификация стволовых клеток рака поджелудочной железы. Cancer Res (2007) 67 (3): 1030–7. doi: 10.1158 / 0008-5472.CAN-06-2030

PubMed Реферат | CrossRef Полный текст | Google Scholar

6. Дай Л., Ли К., Шедден К.А., Ли С.Дж., Ли К., Куок Х.В. и др. Количественное протеомное профилирование стволовых клеток рака поджелудочной железы. J Proteome Res (2010) 9 (7): 3394–402. doi: 10.1021 / pr100231m

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

7. Song L, Chen X, Gao S, Zhang C, Qu C, Wang P и др.Лыжи модулируют характеристики стволовых клеток рака поджелудочной железы посредством регулирования сигнального пути sonic hedgehog. Tumor Biol (2016) 37: 16115–25. doi: 10.1007 / s13277-016-5461-8

CrossRef Полный текст | Google Scholar

10. Чжан С., Сринивасан Ю., Арлоу Д.Х., Фунг Дж. Дж., Палмер Д., Чжэн Ю. и др. Кристаллическая структура высокого разрешения рецептора, активируемого протеазой человека 1. Nature (2012) 492 (7429): 387–92. doi: 10.1038 / nature11701

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

11.Ян Й., Станг А., Швейкерт П. Г., Ланман Н. А., Пол Э. Н., Мония Б. П. и др. Передача сигналов тромбина способствует аденокарциноме поджелудочной железы посредством PAR-1-зависимого уклонения от иммунитета. Cancer Res (2019) 79 (13): 3417–30. doi: 10.1158 / 0008-5472.CAN-18-3206

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

12. Ван Кью, Тан Й, Ван Т., Ян Х.Л., Ван Х, Ма Х и др. EPCR способствует ангиогенезу опухолевых клеток рака желудка человека MGC803 in vitro посредством активации ERK1 / 2 и AKT PAR1-зависимым образом. Oncol Lett (2018) 16 (2): 1565–70. doi: 10.3892 / ol.2018.8869

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

13. Нгуен QD, Wever OD, Bruyneel E, Hendrix A, Xie WZ, Lombet A, et al. Коммутаторы передачи сигналов PAR-1 в инвазии раковых клеток обнаруживают важную роль оси киназы Rho-Rho и микроокружения опухоли. Онкоген (2005) 24 (56): 8240–51. doi: 10.1038 / sj.onc.1208990

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

14.Tekin C, Shi K, Daalhuisen JB, Brink MST, Bijlsma MF, Spek CA. Передача сигнала PAR1 на опухолевые клетки ограничивает рост опухоли, поддерживая мезенхимальный фенотип при раке поджелудочной железы. Oncotarget (2018) 9 (62): 32010–23. doi: 10.18632 / oncotarget.25880

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

18. Такур Р., Триведи Р., Растоги Н., Сингх М., Мишра Д. П.. Ингибирование передачи сигналов, опосредованной STAT3, FAK и Src, снижает нагрузку на раковые стволовые клетки, онкогенный потенциал и метастазирование при раке молочной железы. Sci Rep (2015) 5: 10194. doi: 10.1038 / srep10194

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

19. Агилар-Солис Э.Д., Ли-Ривера I, Альварес-Арсе А., Лопес Э., Лопес-Коломе AM. Фосфорилирование FAK играет центральную роль в индуцированной тромбином миграции клеток RPE. Cell Signal (2017) 36: 56–66. doi: 10.1016 / j.cellsig.2017.04.016

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

20. Syapin PJ, Martinez JM, Curtis DC, Marquardt PC, Allison CL, Groot JA, et al.Эффективное снижение потребления этанола с помощью полусинтетических производных тетрациклина. Alcohol Clin Exp Res (2016) 40 (12): 2482–90. doi: 10.1111 / acer.13253

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

21. Кармена Д., Бенито-Перес де Мендиола А., Санчес-Серрано, LP. Отчетность о кистозном эхинококкозе человека в Испании: насколько эффективна система эпидемиологического надзора? Enferm Infecc Microbiol Clin (2010) 28 (2): 135–6. DOI: 10.1016 / j.eimc.2009.03.013

PubMed Реферат | CrossRef Полный текст | Google Scholar

22. Кармена Д., Бенито-Перес де Мендиола А., Санчес-Серрано, LP. Доксициклин-индуцируемый меланогенный вирус осповакцины как тераностический противораковый агент. Theranostics (2015) 5 (10): 1045–57. doi: 10.7150 / thno.12533 ​​

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

23. Bendeck MP, Conte M, Zhang M, Nili N, Strauss BH, Farwell SM. Доксициклин модулирует рост, миграцию и ремоделирование матрикса гладкомышечных клеток после повреждения артерии. Am J Pathol (2002) 160 (3): 1089–95. DOI: 10.1016 / S0002-9440 (10) 64929-2

PubMed Реферат | CrossRef Полный текст | Google Scholar

24. Чжун В., Чен С., Цинь И, Чжан Х, Ван Х, Мэн Дж и др. Доксициклин подавляет ЭМП и метастазирование рака молочной железы через путь PAR-1 / NF-kappaB / miR-17 / E-кадгерин. Oncotarget (2017) 8 (62): 104855–66. doi: 10.18632 / oncotarget.20418

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

25. Чжун В., Чен С., Чжан К., Сяо Т., Цинь И, Гу Дж и др.Доксициклин непосредственно нацелен на PAR1, чтобы подавить прогрессирование опухоли. Oncotarget (2017) 8 (10): 16829–42. doi: 10.18632 / oncotarget.15166

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

26. Цао X-Y, Zhang XX, Zhang MW, Hu LP, Jiang SH, Tian GA и др. Аберрантная активация KLK10 способствует метастазированию за счет усиления оси EMT и FAK / SRC / ERK в PDAC. Biochem Biophys Res Commun (2018) 499 (3): 584–93. doi: 10.1016 / j.bbrc.2018.03.194

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

27.Ohlund D, Handly-Santana A, Biffi G, Elyada E, Almeida AS, Ponz-Sarvise M и др. Определенные популяции воспалительных фибробластов и миофибробластов при раке поджелудочной железы. J Exp Med (2017) 214 (3): 579–96. doi: 10.1084 / jem.20162024

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

30. Fu QF, Liu Y, Fan Y, Hua SN, Qu HY, Dong SW и др. Альфа-енолаза способствует гликолизу, росту, миграции и инвазии клеток при немелкоклеточном раке легкого посредством FAK-опосредованного пути PI3K / AKT.