Колифаги в воде питьевой: Колифаги в сточной воде, в питьевой воде

Колифаги в сточной воде, в питьевой воде

Колифаги – бактерии вирусы, заражающие бактериальную клетку, а после убивающие ее путем размножения. Чаще всего колифаги обнаруживаются в колиформных бактериях. Данная категория бактериофагов относится к категории, использующейся в качестве индикаторов качества воды и степени ее очистки. Причиной тому – их схожесть с кишечными вирусами человека, а также простота обнаружения при использовании соответствующих методик.

Одними из наиболее изученных на данный момент групп колифагов являются соматические колифаги и F-специфические РНК-бактериофаги. Первые представляют собой микроорганизмы, инфицирующие штаммы организма носителя посредством атаки рецепторов клеточных стеков, вторые – инфицируют штаммы E. Coli, а также схожие с ними бактерии. Представители данных групп чаще всего находятся в сточных водах, уровень же фекального загрязнения ими зачастую незначителен.

Колифаги – как индикаторы загрязнения воды

Популярность колифагов как индикаторов качества водоочистных мероприятий объясняется их персистентностью, то есть способностью долгое время сохранять жизнедеятельность вне организма носителя. Это в свою очередь возможно благодаря устойчивости данных бактерий к воздействию окружающей среды. Таким образом наличие колифаг используется как показатель эффективности мероприятий по очистке воды от загрязнений.

Колифаги в питьевой воде

Санитарно-микробиологическая оценка качества воды выражается в определении большого количества показателей. Данные критерии отражают соответствие или несоответствие состояния питьевой воды установленным требованиям нормативных документов.

Наличие колифагов во взятом образце, в определенном количестве, напрямую указывает на факт фекального загрязнения и необходимость проведения очистных мероприятий. Однако, стоит отметить, что непосредственно в питьевой воде данные микроорганизмы встречаются редко и намного чаще представлены в сточных водах.

Подробная информация об услуге в разделеЭкспертиза воды

 

Колифаги в сточной воде

Сточные воды относятся к основным источникам микробного загрязнения объектов окружающей среды. Это касается как поверхностных вод, так и подземных горизонтов, а такое почвы и питьевой воды. В связи с этим существует серьезный риск распространения возбудителей инфекций путем фекально-орального механизма передачи.

С учетом того, что колифаги, как и колиформы относятся к индикаторам загрязнения воды, проведение исследований образцов воды из таких источников позволит определить отклонения от нормы еще до возникновения серьезных последствий. В случае частого использования воды из поверхностных водоисточников, в особенности в крупных населенных пунктах, вода должна исследоваться регулярно.

Определение колифагов в воде

Для обнаружения колиформных бактерий и/или колифагов осуществляется анализ воды на наличие возбудителей бактериальных и вирусных кишечных инфекций. Для этого используется метод с обогащением. Его особенностью является заблаговременное накопление бактерий в среде на культуре бактерий группы кишечной палочки. Далее определяется просветление газона на питательном агаре.

С помощью данного метода можно контролировать качество воды, которая в первую очередь предназначена для употребления. Анализ производится в такой последовательности:

1. В первую очередь в образец вносится 100 мл питательного бульона и 10 мл смыва E. Coli. Контроль культуры смыва осуществляется путем его размещения в чашке Петри и заливки агаром.
2. Проба воды и чашка Петри помещается в термостат, где инкубируется 18 часов с температурой 37 градусов.
3. По завершении инкубационного периода и в случае необнаружения колифагов, лаборантом отливается 10 мл в пробирку, после чего эта проба освобождается от бактериальной флоры.

Просмотр образца после инкубирования должен проводиться при подходящем свете. Если обнаруживается полный лизис газона или его отдельные зоны на емкости с пробой, она получает положительный статус. В отчете указывается, что колифаги были найдены в 1000 мл воды.

Проведение анализов в лаборатории «НОРТЕСТ»

Испытательный центр «НОРТЕСТ» располагает всеми необходимыми разрешениями и уровнем аккредитации для проведения исследований любой сложности. Наша лаборатория имеет широкую область компетенций, что способствует комплексному решению задач, связанных с оценкой и анализом воды на содержание колифагов и других индикаторных микроорганизмов.

Современное оборудование и квалифицированный штат опытных специалистов позволяют нам эффективно реализовывать передовые методики, направленные на обеспечение низких пределов обнаружения и высокое качество получаемых данных. Занимаясь обслуживанием клиентов, мы действуем прежде всего в их интересах, помогая не только в поисках возможных нарушений, но и подборе средств по их устранению.

Не знаете, какой анализ выбрать? Наши специалисты помогут!

Позвоните нам: +7 (495) 108-24-26 или заполните форму

Заявка на анализ

Телефон*

Сообщение

Я согласен(а) наобработку персональных данных

Колифаги присутствующие в воде

Синоним: бактерии вирусы, колиформные бактерии

Характеристика: это вирусные бактерии, целью которых является сначала заразить бактериальную клетку, а после убить ее при помощи размножения. Эти бактериофаги относятся к той категории, которая применяется для вычисления показателя качества воды и определения необходимой очистки. Причиной стала их подобность с человеческими кишечными вирусами. Кроме того, они просты в выявлении при применении подходящих методик.

Распространение и применение

Колифаги в основном, распространены и присутствуют в колиформных бактериях. В данное время наиболее известными из групп колифагов считаются:

1. Соматические колифаги
2. F-специфические РНК-бактериофаги.

Соматические – это микроорганизмы, которые заражают определенный вид микроорганизмов или вирусов в человеческом организме. Этот процесс происходит путем атаки рецепторов клеточных стеков. Вторая группа же инфицирует штаммы E. Coliи бактерии, имеющие с ними что-то схожее. Оба представителя указанных категорий в большинстве случаев содержатся в сточных водах.

В связи с вышеперечисленными особенностями и популярностью колифагов, они получили своё широкое применение в качестве индикаторов.

Точнее, используются, как индикаторы качества водоочистных систем. Их особенностью является сохранение жизнедеятельности долгий промежуток времени после выхода из организма носителя. Такое явление возможно ввиду живучести этих бактерий, несмотря на влияние окружающих условий. Поэтому колифаги являются индикатором продуктивности процедур по очищению вод от засорений.

Влияние на организм

Присутствие колифагов в питьевой или технической воде несет серьезную опасность для здоровья человека. Известно, что загрязнение водных объектов главным образом происходит посредством сточных вод. Это также имеет отношение к поверхностным и подземным водам, а также к воде для питья и грунтам. Поэтому всегда присутствует серьезная вероятность распространения инфекционных возбудителей через фекально-оральные способы передачи.

Если при взятии пробы и после проведения её исследования выявлено определенное количество бактерий, то это указывает на засорение фекалиями, а значит, на требуемые очистные операции. Важно знать, что в питьевых водах эти частицы присутствуют очень редко и являются проблемой стоков.

Санитарно-микробиологическая оценка водных ресурсов заключается в количественной оценке данных, которые показывают, соответствует жидкость предельно-допустимым нормам или нет.

Определение

Для того, чтобы выполнить анализ водных сред на присутствие болезнетворных возбудителей кишечных инфекций, применяется метод обогащения. Он заключается в накоплении бактерий заранее и дальнейшем выявлении на живительном агаре.

Используя этот способ, становится возможным регулировать свойство и качество жидкости, предназначенной для питьевого пользования.

Ниже приводится алгоритм выполнения процедуры очищения:

• Для начала в пробу добавляют питательный бульон (100мл) и смыв (10мл) E. Coli.
• Следующем этапом смыв помещают в чашку Петри и заливают агаром.
• Далее образец и чашка ставится в термостат на 18 часов при температуре 37 градусов.
• После окончания инкубационного периода, если выявлены колифаги, 10 мл помещаются в пробирку.

Для точной оценки пробы после прохождения инкубационного периода используются хорошо освещенные объекты. По итогам проверки лаборатория определяет, были ли обнаружены данные типы микроорганизмов в литре воды.

Допустимые нормы

Поскольку присутствие колифагов в питьевой или технической воде несет прямую угрозу человеческому здоровью, их содержание строго регламентируется. В большинстве источников, в том числе пищевых, подобных микроорганизмов не должно быть вовсе. В других же их содержание допускается, но в минимальном количестве.

Предельно допустимая концентрация колифагов в различных источниках проб

Источник образца Нормативный акт	Концентрация
Питьевая и централизованная вода СанПиН 2. 1.4.1074-01	0
Бассейны СанПиН 2.1.2.1188-03	0
Рекреационные водоемы СанПиН 2.1.5.980—00	10 БОЕ/100 мл

Способы очистки

Существует немалое количество способов обеззаразить жидкость, но самыми востребованными являются следующие:

1. Хлорирорование. Подходит, если вода используется для бытовых или хозяйственных нужд. Имеет ряд весомых недостатков.
2. Метод озонирования основывается на способности активного оксигена распадаться в водной среде, что разрушает вирусные клетки. Способ нашел своё применение в очистных системах бассейнов и станциях централизованного водоснабжения.
3. Ультрафиолетовыми лучами. В данное время самый экономичный и оправданный способ для стерилизации жидких структур.
4. Обратный осмос.

Почему колифаги являются новыми вирусными индикаторами в микробиологическом анализе воды?

БЛОГ | Bluephage

28 июня 2021 г.

Неотложность улучшения качества воды

• 1 миллиард человек не имеет доступа к безопасной питьевой воде

• 270 болезней, связанных с загрязненной водой во всем мире

• 5 миллионов передающихся через воду патогенных инфекций/год в США

• 2 миллиона госпитализаций в год в развитых странах из-за патогенов, передающихся через воду. В настоящее время он выполняется с помощью бактериальных индикаторов, но с 2018 года

  ВОЗ рекомендует оценивать анализ колифага в программах эпиднадзора с учетом местных условий и научных критериев. В начале 2021 года новые Европейская директива о питьевой воде требует мониторинга колифагов, поскольку это является полезным фекальным индикатором , так как он определяет, содержит ли исходная вода более 50 пластинообразующих единиц на 100 мл аликвоты .
  Почему вирусные индикаторы? Вирус против бактерий
  Бактериальные индикаторы ограничены и не могут обнаружить присутствие вирусных патогенов.

  Колифаги являются лучшими индикаторами качества воды, потому что они:

  • В 50 раз меньше, чем бактерии
  • Большая численность и устойчивость в окружающей среде
  • Более устойчивы к обработке
  • Более высокая скорость репликации, чем у бактерий

  Сравнение: бактерии и вирусы размер

  Что такое бактериофаги, и где они находятся?
  • Различные типы бактериофагов были предложены в качестве фекальных или вирусных индикаторов загрязнения воды, твердых биологических веществ и пищевых продуктов.
  • Бактериофаги определяются или классифицируются в соответствии с бактериальным штаммом-хозяином, который они заражают.
  • Бактериофаги — это бактериальные вирусы, обладающие многими свойствами, схожими с вирусами человека или животных, такими как состав, структура, морфология или размер капсида.
  Бактериофаги ведут себя как вирусы человека/животных в отношении:
  • Циркуляции через фильтры (мембраны, ультрафильтрация…).
  • Поверхностная адсорбция (частицы, мембраны…)
  • Физическая и химическая устойчивость к дезинфекции
  • Повышенная устойчивость к дезинфекции при адсорбции на твердых поверхностях.
  Дополнительные преимущества бактериофагов
  • При фекальном загрязнении бактериофаги преобладают над человеческими вирусами (за исключением больных людей).
  • Высокие и очень постоянные концентрации в сточных водах
  • Стабильность при 4°С в течение 48 часов и в течение месяцев при -20°С или -80°С с 10% об/об глицерина
  • Ошибки, вызванные бактериальными индикаторами из-за явлений стресса, реактивации, поврежденных метаболических форм… устранены.
  • Быстрое, простое и недорогое обнаружение.
  Связь, наблюдаемая между бактериофагами и цитопатогенными энтеровирусами при вторичном и третичном лечении:
  Группы бактериофагов, предложенные в качестве индикаторов.  
  Классификация по штамму бактерии-хозяина, который они заражают

  Соматические колифаги

  • Заражение coli через клеточную стенку 706)

  F-специфические колифаги

  • Заражают coli и другие энтеробактерии половыми пилями, обнаруженными на плазмиде
  • Штамм-хозяин Salmonella typhimurium WG49 и E.coli HS

  Бактериофаги Bacteroides fragilis

  • Заражение Bacteroides fragilis через клеточную стенку (HSP40, RYC2056)

  Ассортимент продуктов

  Bluephage 900 04 состоит из набора «все в одном» и биологических сред, подготовленных для экономии времени и ресурсов. для обнаружения и количественного определения F-специфических и соматических колифагов в воде, соответственно, в соответствии с протоколами ISO и US-EPA в образцах объемом 100 мл и 1 мл.

  Методы концентрации и подсчета соматических колифагов в пробах воды

  Резюме

  Соматические колифаги являются новым индикатором для мониторинга эффективности водоподготовки и очистки в Директиве (ЕС) 2020/2184 Европейского парламента и Совета от 16 декабря 2020 г. о качестве воды, предназначенной для потребления человеком, и в Регламенте ( EU) 2020/741 Европейского парламента и Совета от 25 мая 2020 года о минимальных требованиях к повторному использованию воды. По этой причине необходимо будет в ближайшее время постепенно внедрять метод определения соматических колифагов в воде в тех или иных операционных или других лабораториях. Возможность использования процедуры выращивания в соответствии с процедурой стандарта ČSN EN ISO 10705-2 рассматривается с 2019 года.в микробиологической лаборатории факультета водных технологий и экологии Химико-технологического университета в Праге. Соматические колифаги были обнаружены в пробах воды различной степени загрязнения, в частности в поверхностных водах, сточных водах (сточные воды очистных сооружений) и серых водах.

  Отдельные методы концентрирования (флокуляция гидроксида магния и мембранная фильтрация), которые необходимо использовать для проб воды с низкой концентрацией соматических колифагов (< 3 БОЕ/мл), также были протестированы и подтверждены экспериментально. На основании проведенных испытаний установлено, что метод мембранной фильтрации с использованием электроотрицательных фильтров показывает более высокую эффективность концентрирования соматических колифагов из пробы воды, чем флокуляция с гидроксидом магния.

  Введение

  В последние годы из практики водоснабжения известны случаи заражения питьевой воды вирусными агентами, будь то случаи, связанные с появлением энтеровирусов, норовирусов или аденовирусов. Эти случаи были освещены прессой и профессиональной общественностью. Вирусы обычно считаются более устойчивыми живыми системами (организмами) к биологическим и физико-химическим воздействиям окружающей среды, чем бактерии. Несмотря на опасность этого микроорганизма, требование его определения в рамках проводимых микробиологических анализов воды не учитывается, например, Постановлением № 252/2004 Сб.

  с изм., устанавливающим гигиенические требования к питьевой и горячей воде а также периодичность и объем контроля качества питьевой воды. Большинство вирусов невозможно обнаружить с помощью процедуры культивирования: вместо этого используются методы молекулярной биологии (например, ПЦР = полимеразная цепная реакция), которые требуют соответствующего дорогостоящего лабораторного оборудования. Определение некоторых типов вирусов путем культивирования трудно выполнить в собственной микробиологической лаборатории, поскольку требуются клетки-хозяева из выбранных бактериальных штаммов и оптимизированные процедуры.

  Соматические колифаги в настоящее время являются широко обсуждаемой темой в области контроля качества воды, поскольку они демонстрируют некоторое морфологическое сходство с энтеровирусами человека и могут рассматриваться как возможные организмы-индикаторы вирусного заражения воды. В связи с постоянно растущими требованиями к качеству питьевой воды и давлением общества на повторное использование очищенных сточных вод соматические колифаги были законодательно предложены в качестве новых индикаторов для контроля эффективности очистки и очистки воды. По этой причине крайне желательно контролировать их присутствие в определенных типах воды, особенно в воде, предназначенной для потребления человеком. Соматические колифаги представляют собой группу непатогенных бактериальных вирусов, называемых «бактериофагами», которые инфицируют клетки колиформных бактерий ( Enterobacteriaceae группы ) и, в частности, клетки бактерии Escherichia coli ( E . coli ). Природной средой для соматических колифагов является, как и для бактерий E. coli , желудочно-кишечный тракт человека и теплокровных организмов.

  12 января 2021 года вступила в силу Директива Европейского парламента и Совета (ЕС) 2020/2184 от 16 декабря 2020 года о качестве воды, предназначенной для потребления человеком, которая представляет собой полностью переработанную поправку к Директиве 9.8/83/ЕС. Предпосылкой имплементации настоящей Директивы в национальное законодательство является конец 2022 – начало 2023 года.

  Целью Директивы о питьевой воде является защита здоровья потребителей от последствий использования загрязненной воды и обеспечение безопасности питьевой воды посредством определенных стандартов качества, которые должны соблюдать государства-члены ЕС. Среди прочего, пересмотр был направлен на обновление перечня показателей качества питьевой воды, которые уже не соответствовали современным знаниям. Соматические колифаги являются новым показателем, который необходимо будет проверять при оперативном мониторинге эффективности процесса очистки питьевой воды, если в источнике сырой воды будет обнаружено > 50 БОЕ/100 мл (БОЕ = бляшкообразующая единица) [1].

  Соматические колифаги также упоминаются в новом Регламенте 2020/741 Европейского парламента и Совета (ЕС) от 25 мая 2020 г. о минимальных требованиях к повторному использованию воды [2]. Этот регламент должен облегчить повторное использование очищенных городских сточных вод государствами-членами Европейского союза (ЕС), особенно для орошения в сельском хозяйстве. Помимо минимальных требований к качеству оборотной воды, в регламенте также оговаривается периодичность регламентного и проверочного контроля. Соматические колифаги должны оцениваться в рамках валидационного мониторинга устройства для категории с наиболее жесткими требованиями к качеству воды (класс А, для которого применяется следующее: «Все пищевые культуры, потребляемые в сыром виде, съедобная часть которых находится в непосредственном контакте с с оборотными сточными водами, а корнеплоды потребляются в сыром виде») [2]. Целью валидационного мониторинга является оценка эффективности устройства при удалении отдельных индикаторных организмов патогенных бактерий, простейших и вирусов.

  После публикации принятых законодательных документов в Официальном журнале ЕС государства-члены ЕС впоследствии обязаны внести соответствующие изменения в свое законодательство. Правила ЕС могут применяться непосредственно в государствах-членах ЕС. Поэтому метод определения соматических колифагов в воде необходимо будет внедрить в каких-либо операционных или других лабораториях, и этим лабораториям затем придется уделить некоторое время оптимизации метода.

  Возможность использования процедуры культивирования в соответствии с процедурой стандарта ČSN EN ISO 10705-2 [3] систематически рассматривается с 2019 года.в микробиологической лаборатории факультета водных технологий и экологии Химико-технологического университета в Праге. Метод, введенный настоящим стандартом, используется для обнаружения соматических колифагов в разнонагруженных водах. При апробации методики определения по указанному стандарту учитываются возможности и возможные применения метода, установленного стандартом [3] для планового микробиологического контроля состояния микробной обсемененности (или фекальной обсемененности) поверхностных вод, сточных вод (сточных вод сточных вод). очистные сооружения), и были выявлены серые воды. Для интереса в тесты также была включена питьевая вода. Методы концентрирования, которые необходимо использовать для проб воды с низким уровнем соматических колифагов (< 3 БОЕ/мл) и которые перечислены в стандарте ČSN ISO 10705-3 [4] (действителен с 1 декабря 2020 г.), были протестированы и проверены экспериментально. Процедуры определения и проблемы, связанные с методами, указанными в стандарте ČSN EN ISO 10705-2 [3] и в стандарте на методы концентрации ČSN ISO 10705-3 [4], обсуждаются далее в статье.

  Методология

  Для определения соматических колифагов были отобраны пробы поверхностных вод, стоков очистных сооружений, сточных и питьевых вод. Соматические колифаги впоследствии определяли в соответствии с процедурой, указанной в стандарте ČSN EN ISO 10705-2 [3], Часть 2: Количественное определение соматических колифагов. В связи с тем, что метод больше подходит для вод с более высокой распространенностью соматических колифагов, выбраны методы концентрирования, предложенные в Приложении А стандарта ČSN ISO 10705-3 [4], часть 2: Валидация методов концентрирования бактериофагов из воды (метод мембранной фильтрации и флокуляция гидроксидом магния) проверены экспериментально.

  Методика определения соматических колифагов

  Метод определения согласно ČSN EN ISO 10705-2 [3] заключается в культивировании и поддержании соответствующего штамма-хозяина E. coli , который впоследствии используется для определения соматических колифагов методом двухслойного титрования бляшек. В целях тестирования штамм-хозяин E. coli был получен из коллекции Государственного института общественного здравоохранения в Праге под обозначением CNCTC 5005. Из полученного лиофилизированного эталонного штамма-хозяина постепенно готовили исходную и рабочую культуры с использованием модифицированная среда Шолтенса (MSB). Требуемая плотность (10 ⁸ КОЕ/мл) клеток рабочей культуры проверяли спектрофотометрически путем измерения поглощения до определения соматических колифагов на основе предварительной калибровки между поглощением и количеством колоний, выращенных на модифицированной среде MSA Шолтенса.

  В дальнейшем определение соматических колифагов per se проводили по стандартной методике, приведенной в стандарте [3] с небольшими изменениями. Для темперирования расплавленной полужидкой среды Шолтенса (ssMSA) с добавлением хлорида кальция использовали водяную баню при 45 °C. Всего 2,5 мл среды ssMSA, 1 мл инокулята культуры штамм-хозяин E. coli и по 1 мл анализируемого образца последовательно пипетировали в стерильные бактериологические пробирки, помещенные на водяную баню. Смесь перемешивали и затем выливали на поверхность полной среды MSA в чашке Петри. После затвердевания чашки инкубировали в подвешенном состоянии при 37°С в течение примерно 18 часов. Соматические колифаги образуют видимые зоны яркости на поверхности среды, так называемые бляшки, которые считывают и в дальнейшем выражают как число бляшкообразующих единиц (БОЕ) в единице объема. Для проверки правильности методики также проводили контрольное определение, представляющее собой смесь инокулята культуры штамма-хозяина и полужидкой среды ssMSA.

  Методы концентрирования

  Эффективность выбранных методов концентрирования, в данном случае мембранной фильтрации и флокуляции с гидроксидом магния, была экспериментально проверена на реальных пробах сточных вод, отобранных из стоков муниципальных механически-биологических очистных сооружений (ОСОС). Оба метода были протестированы методом стандартной добавки. Для определения эффективности флокуляции 10 мл пробы сточных вод КОС дозировали в 90 мл стоячей водопроводной воды. В случае испытания мембранной фильтрации 1 мл (или 10 мл) пробы стоков КОС пипеткой добавляли к 100 мл (или 90 мл) дистиллированной воды. В образце сточных вод КОС, т.е. в образце для добавления, параллельно определяли соматические колифаги в соответствии со стандартом ČSN EN ISO 10705-2 [3]. Приготовленные таким образом суспензии впоследствии подвергали предварительной обработке методами индивидуального концентрирования для захвата колифагов.

  Метод флокуляции с гидроксидом магния заключается в отделении колифагов, захваченных в образовавшихся хлопьях. К тестируемому объему приготовленного образца постепенно добавляют растворы хлорида магния (1 моль/л) и гидрофосфата калия (1 моль/л) в объеме, указанном в стандарте ČSN ISO 10705-3 [4]. Раствор гидроксида натрия (2 моль/л) добавляют по каплям до получения видимого помутнения, одновременно проверяя значение рН, которое не должно превышать 8,6. Суспензию медленно перемешивают в течение примерно 15 минут, в течение которых образовавшиеся хлопья оседают примерно на 30 минут. После осторожного удаления надосадочной жидкости тонкий осадок концентрируют центрифугированием на низкой скорости (относительное центробежное ускорение RCF = 1000 g) в течение 15 минут. После декантации надосадочной жидкости осадок ресуспендируют в пептонной воде с хлоридом натрия при энергичном встряхивании. Затем проводят определение соматических колифагов в соответствии со стандартом ČSN EN ISO 10705-2 [3]. Влияние рН на флокуляцию (рН: 7,6; 8,0; 8,3; 8,6 и 9.0) также контролировали для проверки эффективности метода концентрирования.

  Метод мембранной фильтрации заключается в фильтрации заданного объема пробы через электроотрицательный фильтр, изготовленный из смеси ацетата целлюлозы и нитрата целлюлозы, с размером пор 0,22 мкм и диаметром 47 мм. Фильтрованию предшествует добавление раствора хлорида магния. Затем фильтр разрезают примерно на 8 более мелких частей и помещают в стеклянную колбу с раствором для элюции (1 % экстракт крупного рогатого скота, 0,5 моль/л NaCl, 3 % Tween 80), который помещают в ультразвуковую ванну примерно на 4 минуты. Параллельно определяют соматические колифаги, вышедшие в элюирующий раствор и собранные на фильтрах. В рамках проверки эффективности метода также отслеживали влияние состава элюирующего раствора (здесь: 1 % бычий экстракт, 0,5 моль/л NaCl; 1 % бычий экстракт, 0,5 моль/л NaCl, 3 % твин). 80; 3% экстракт крупного рогатого скота, 0,5 моль/л NaCl; 3% экстракт крупного рогатого скота, 0,5 моль/л NaCl, 3% твин 80).

  Результаты и обсуждение

  Наличие соматических колифагов в водной среде обычно указывает на загрязнение, вызванное фекалиями животных или человека. Хотя они являются естественными штаммами-хозяевами соматических колифагов бактерии E. coli , некоторые исследования показали, что они могут использовать для своей репликации другие родственные виды бактерий, не имеющие фекального происхождения [5]. Сравнение встречаемости соматических колифагов в водах с различной нагрузкой или в питьевой воде, поверхностных водах, серых водах и в очищенных сточных водах (сточные воды очистных сооружений) видно в Таблица 1 . Определение проводили по методике, указанной в стандарте ČSN EN ISO 10705-2 [3]. В исследованных поверхностных водах численность соматических колифагов колебалась от 0 до 25 БОЕ/мл. В связи с тем, что были взяты и проанализированы разные типы поверхностных вод (проточные, стоячие) с разных участков, среднее значение количества БОЕ не приводится. Из протестированных вод наибольшее количество соматических колифагов было обнаружено в сточных водах очистных сооружений. Всего было испытано 6 различных СОСВ, при этом содержание соматических колифагов в сточных водах колебалось от 8 до 84 БОЕ/мл при среднем значении около 42 БОЕ/мл. Лабораторные соматические колифаги в сточных водах на входе КОС пока не обнаружены (причина – повышенная встречаемость сопутствующей микрофлоры, которая мешает считыванию налета при оценке). Для полноты картины в профессиональной литературе указывается количество соматических колифагов на притоках к КОС в диапазоне от 5·10 ⁶  БОЕ/100 мл до 5·10 ⁷ БОЕ/100 мл [6]. В пробах сточных вод, в которых наличие колиформных бактерий и, возможно, E. coli является обычным явлением и было подтверждено в проанализированных пробах (см. Таблица 1 ), наличие соматических колифагов не было подтверждено культивированием. Как и ожидалось, в питьевой воде, взятой из-под крана потребителя, не было обнаружено присутствия соматических колифагов.

  Таблица 1. Встречаемость соматических колифагов в различных типах вод – методика согласно стандарту ČSN EN ISO 10705-2 [3]

  В связи с тем, что для определения соматических колифагов по стандарту ČSN EN ISO 10705-2 [3] используется 1 мл пробы для анализа, данная процедура может привести к ошибке и неправильной интерпретации результатов испытаний при анализе вод с более низкая концентрация колифагов и более низкое микробное загрязнение. Воды с меньшей микробной активностью (например, поверхностные стоячие и проточные воды, сточные воды и питьевая вода) требуют предварительной обработки пробы методом их концентрирования согласно ČSN ISO 10705-3 [4]. Использование надежного метода концентрирования соматических колифагов в пробе воды перед ее анализом позволяет значительно повысить эффективность обнаружения. Графики в Рис. 1 — 3 показывают установленную лабораторией эффективность методов концентрирования флокуляции гидроксида магния и мембранной фильтрации. В методе флокуляции гидроксида магния эффективность концентрирования соматических колифагов колебалась от примерно 32% до 64%, и была обнаружена ее зависимость от рН. Наибольшее количество соматических колифагов было определено для образцов с рН 8,0 (эффективность концентрирования около 64%) и 8,3 (эффективность концентрирования около 64%), см. 9.0051 Рис. 1 . Можно предположить, что эффективность улавливания колифагов в хлопьях будет выше при концентрировании более органически насыщенной воды. Метод мембранной фильтрации показал значительно более высокую эффективность по сравнению с флокуляцией. В зависимости от используемого элюирующего раствора эффективность варьировалась от 40% до 100%, см. Рис. 2 . Содержание неионогенного поверхностно-активного вещества Tween 80 в элюирующем растворе необходимо для выхода соматических колифагов из мембранных фильтров. С его помощью в большинстве случаев достигалась около 100% эффективность концентрирования соматических колифагов. Как видно на Рис. 3 , хлорид магния (который добавляется в пробу перед фильтрацией) также важен в процессе концентрирования методом мембранной фильтрации. Без его использования средняя эффективность захвата соматических колифагов составляла от 19% до 52%, в зависимости от раствора для элюирования. Поливалентные катионы, такие как Mg ²⁺ , Ca ²⁺ и Al ³⁺ , позволяют более эффективно адсорбировать колифаги на электроотрицательных мембранных фильтрах при более низком рН [7].

  Рис. 1. Эффективность флокуляции гидроксида магния при концентрации соматических колифагов и влияние рН

  Рис. 2. Эффективность мембранной фильтрации по методике ЧСН ИСО 10705-3 [4] (включая добавление MgCl

  ₂ ) при концентрации соматических колифагов и влияние различных элюирующих растворов

  Рис. 3. Эффективность мембранной фильтрации по методике ЧСН ИСО 10705-3 [4] (без добавления MgCl

  ₂ ) при концентрации соматических колифагов и влияние различных элюирующих растворов

  Проблемы определения соматических колифагов в водах

  В представленном случае было проведено определение соматических колифагов, за исключением нескольких незначительных модификаций, в соответствии с действующим стандартом ČSN EN ISO 10705-2 [3]. К таким незначительным изменениям относится, например, порядок нанесения отдельных компонентов на бактериологические пробирки. Первоначально, в основном из-за быстрого затвердевания (слипания) полужидкой среды ssMSA, было предпочтительно сначала нанести 1 мл испытуемого образца, 1 мл инокулята и только впоследствии добавить 2,5 мл среды ssMSA. Однако при использовании контрольных холостых проб было обнаружено, что первоначальное нанесение образца в бактериологические пробирки впоследствии может вызвать перекрестную контаминацию инокулята и среды ssMSA колифагами. Таким образом, предпочтительным было применение в следующем порядке: полужидкая среда ssMSA, посевная культура, испытуемый образец. Решением проблемы быстрого затвердевания полужидкой среды ssMSA может быть либо добавление меньшего количества агара (с риском скольжения верхнего слоя), либо выбор агара с более низкой температурой затвердевания. В качестве альтернативы испытуемый образец можно наносить на бактериологические пробирки таким образом, чтобы он медленно стекал по закаленной стенке пробирки. Приготовленную смесь всегда слегка перемешивали вручную для предотвращения образования пузырьков воздуха и быстро выливали на полную среду МСК в чашки Петри. Оценке или чтению образовавшихся бляшек соматических колифагов мешает не только наличие пузырьков воздуха, но и наличие конденсированной воды, налипшей на поверхность затвердевшего верхнего слоя (даже в подвешенном состоянии). По этой причине перед инкубацией посуду следует предварительно высушить с частично открытыми крышками в лабораторном термостате (это указано в стандарте ČSN EN ISO 10705-2 [3] и это важно).

  При экспериментальной проверке выбранных методов концентрирования, описанных в стандарте ČSN ISO 10705-3 [4], также были обнаружены некоторые проблемные процедуры. В случае метода флокуляции с гидроксидом магния седиментации всех образовавшихся хлопьев не происходило заметно. Чтобы захватить как можно больше, необходимо было центрифугировать больший объем образца или использовались пробирки на 50 мл. Ресуспендирование образовавшегося осадка в пептонной воде, содержащей NaCl, может быть проблематичным при использовании менее 30 мл; в некоторых случаях не удавалось растворить хлопья ни при энергичном встряхивании, ни при встряхивании. В случае образца с низкой концентрацией колифагов (< 3 БОЕ/мл), который концентрируют флокуляцией, целесообразно работать одновременно с двумя его разными объемами, хотя бы один из которых позволит количественно определить бляшки в 1 мл (или 5 мл) от общего объема 30 мл.

  По сравнению с флокуляцией метод мембранной фильтрации значительно быстрее и проще. Наиболее проблематична в данном случае работа с фильтрами. После фильтрации образца отдельные фильтры следует разрезать примерно на 8 частей, обработать в ультразвуковой ванне, а затем приложить лицевой стороной вниз к слою среды ssMSA с штаммом-хозяином. Одновременно с фильтрами определяют элюирующий раствор по методике согласно ČSN EN ISO 10705-2 [3]. Эта работа с фильтрами не только требует определенного навыка обращения с пинцетом, но и не приносит ожидаемых результатов, либо соматические колифаги в виде бляшек не могут быть достоверно считаны с культивируемых чашек, см. Рис. 4 .

  Рис. 4. Определение соматических колифагов методом мембранной фильтрации – проблематичный подсчет захваченных колифагов на фильтрах

  Заключение

  Признак фекального загрязнения является важным инструментом для определения безопасности воды. В последнее время внимание переключилось на другие возможные организмы-индикаторы, особенно на соматические колифаги, которые можно использовать для мониторинга эффективности удаления мелких и более устойчивых частиц (например, вирусов) при обработке или очистке воды. В рамках испытаний, проведенных в микробиологической лаборатории кафедры водной техники и экологии Химико-технологического университета в Праге, было установлено, что методика определения соматических колифагов согласно ČSN EN ISO 10705-2 [3] является не подходит для питьевой воды, сточных вод и некоторых поверхностных вод; то есть там, где ожидается очень низкая или нулевая концентрация колифагов. Для этих типов вод в большинстве случаев будет необходимо использовать методы концентрирования, указанные в ČSN ISO 10705-3 [4], которые будут преобразовывать соматические колифаги из пробы большего объема в меньший объем. Методы выбираются на основе объема пробы, содержания частиц или мутности. Из опыта, полученного к настоящему времени с помощью метода флокуляции гидроксида магния и мембранной фильтрации на электроотрицательных фильтрах, можно сказать, что последний метод способен более эффективно концентрировать соматические колифаги из пробы воды.